心肌缺血心功能不全证候生物学基础与益心解毒方药理药效机制的实验研究目的基于心肌缺血心功能不全病证结合动物模型,采用分子生物学技术与气相色谱质谱联用(Gas Chromatography and Mass Spectrometry, GC-MS)的代谢组学技术,探讨心肌缺血心功能不全不同证候及其演变规律的生物学基础；利用临床确有疗效的益心解毒方,对该模型气虚血瘀证的时间窗进行干预,完成益心解毒方治疗心肌缺血心功能不全气虚血瘀证的疾病与证候两个层面的药效评价,并进一步揭示该复方的药理药效作用环节与机制；同时,从益心解毒方的组成成分出发,利用生物信息学技术预测该复方可能作用的药物靶标,并对其进行生物学验证,为中药复方靶标的预测与药理机制的研究提供新的思路与方法。方法1.通过左冠状动脉前降支结扎术制备心肌缺血心功能不全动物模型,术后进行动态宏观表征观察与行为学指标的采集,对该模型不同时间点的证候属性作出判断；2.利用酶联免疫法检测心肌缺血心功能不全大鼠术后4d、7d、21d、45d、60d等时间点的血清中肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白细胞介素-1(interleukin-1,IL-1)、IL-6以及基质金属蛋白酶2(matrix metalloprotein 2, MMP2)、MMP9等指标的含量；通过Pearson相关性分析,揭示TNF-α效能转变在心肌缺血不同疾病阶段证候演变中的作用；3.利用GC-MS的代谢组学技术对不同证候(包括气虚证与气虚血瘀证)心肌缺血心功能不全大鼠的血浆代谢物进行检测；并通过主成分分析方法(PCA)探讨该疾病不同证候的特征性代谢产物；4.通过益心解毒方干预心肌缺血心功能不全大鼠气虚血瘀证时间窗,通过宏观表征观察与微观理化指标相结合的方式,综合评价该复方在疾病与证候层面的药理药效作用；5.利用分子生物学技术如酶联免疫法(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)、免疫组化法(Immunohistochemistry, IHC)、蛋白免疫印迹(Western bloting, WB)等,对通过文献研究寻找到的与冠心病心肌缺血心功能不全病理机制密切的关键节点分子进行检测；揭示中药复方多靶点、多途径治疗心肌缺血心功能不全的药理环节与机制；6.从中药复方的组成成分出发,利用已知中药成分／化学结构在drugbank中寻找FDA公示的该成分的作用靶标,通过KEGG通路分析将所有的靶标分子进行通路富集；寻找出该中药复方最有可能的作用机制；并利用动物模型与生物学技术对相关通路进行验证。结果1.采用宏观表征等效对应临床四诊信息的方法确定基于左冠状动脉前降支结扎所致的心功能不全大鼠模型在7-28d表现为稳定的气虚血瘀证候时间窗,而4-7d,45-60d为稳定的气虚证时间窗。其证候发生了从“气虚证-气虚血瘀证-气虚证”转化的演变规律；2.血清酶联免疫法结果显示：模型大鼠术后血清中的TNF-α浓度与假手术组相比表现为持续升高(P<0.05),而其它炎症因子如IL-1,IL-6的升高(P<0.05)则主要出现在术后的4-21d；术后45-60d,除TNF-β仍高于其同期假手术组,IL-1,IL-6均恢复至正常；术后45-60d,射血分数(Ejection fraction, EF)值低于50%,MMP-9,MMP-2等与心肌重构相关的指标分别上升了9.91%和20.57%,而炎症相关指标IL-1, IL-6均恢复致正常水平。通过对TNF-α与MMP-9,MMP-2和EF值的相关分析发现,TNF-α的浓度的上调与MMP-9,MMP-2的上调、EF的下降存在明显的相关性。3.术后4d,与假手术组相比,模型组代谢物的改变包括：能量代谢产物柠檬酸(Citric acid),环磷酸腺苷(CAMP);氨基酸代谢物甘氨酸(Clycine)等；糖代谢物a-D-葡萄糖苷(a-D-glucopyranoside),脂类代谢物如月桂酸(Dodecanoic acid)等含量上升；氨基酸代谢丙氨酸(alanine)等；糖代谢产物d-葡萄糖(d-Glucose)等以及脂肪酸代谢产物丁酸(Propanoic acid)等含量下降。术后21d,模型组代谢物的改变包括：能量代谢产物Citric acid、氨基酸代谢物Urea、L-Serine等,糖代谢物a-D-glucopyranoside,脂类代谢物如Hexadecanoic acid、Octadecanoic acid等含量上升；能量代谢产物CAMP、氨基酸代谢物甘氨酸(Clycine)等含量下降。术后45d,模型组代谢物的改变包括：氨基酸代谢L-Serine;脂代谢产物Propanoic acid、Butanoic acid含量上升；而能量代谢物Citric acid、CAMP;氨基酸代谢产物Urea、L-Serine等；糖代谢产物a-D-glucopyranoside;脂肪酸代谢产物Hexadecanoic acid, Octadecanoic acid含量下降。4.在益心解毒方的药效研究中,疾病层面的药效评价包括：在动脉血流动力学方面,益心解毒方组和阳性药组均能明显改善动脉的收缩压(Systolic blood pressure, SBP)和舒张压(Diastolic blood pressure, DBP),并能有效的提高动脉的平均动脉压(Mean arterial blood pressure, MAP) (P＜.05);在心室血流动力学方面,益心解毒方和福辛普利钠均能上调心功能不全大鼠的LVSP、左室收缩压最大上升速率(maximal rate of left ventricular systolic pressure, LV+dP/dt max)和左室舒张压最大上升速率(maximal rate of left ventricular diastolic pressure, LV-dP/dt max),进而改善心衰大鼠的心室血流动力学状况。血生化结果显示：与假手术组相比,模型组大鼠血浆中各种心肌酶类如丙氨酸转氨酶(Alanine transaminase, ALT)、天冬氨酸转氨酶(Aspartate aminotransferase, AST)、血清肌酸磷酸激酶(Aspartate aminotransferase, CK)、肌酸激酶同工酶(Aspartate aminotransferase, CK-MB)、乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase, LDH)、肌钙蛋白Ⅰ(Cardiac troponinⅠ, CTNi)显著上升,给予益心解毒方后,能够有效的降低心衰大鼠血液中上升的心肌酶类；同时阳性对照药在心肌酶调节方面也有相应的改善。益心解毒方组与福辛普利钠均能够降低模型大鼠血浆中血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ, AngⅡ)的浓度,并且降低心衰大鼠血浆脑利钠肽(Brain natriuretic peptide, BNP)水平(P<0.05)。同时,免疫比浊法结果显示给予益心解毒方干预后,心衰大鼠的血清高敏C反应蛋白(High-sensitivity C-reactive protein, hs-CRP)显著下降(P<0.05),说明益心解毒方具有一定的抗炎作用。证候层面的药效评价包括：益心解毒方治疗的大鼠足底皮肤及阴囊皮肤的红(Red,R)值、绿(Green,G)值、蓝(Blue,B)值均下降(P<0.05)；呼吸频率测定结果显示与假手术组大鼠相比,模型组大鼠安静状态下呼吸频率明显加快,而益心解毒方能够有效的减慢心衰大鼠加快的呼吸频率(P<0.05),阳性药组在改善心衰大鼠的呼吸频率方面与模型组无显著性差异。超声结果显示：益心解毒方组能有效的降低心衰大鼠扩张的左室舒张末内径(Left ventricular end-diastolic diameter, LVEDd)和左室收缩末内径(Left ventricular end-stolic diameter, LVEDs)(分别下降22.10%和28.57%,P<0.05),尤以改善收缩末内径为主；且进一步提高射血分数(Ejection fraction, EF)(P<0.05)；福辛普利钠仅能改善心衰大鼠的EF值,对LVEDd和LVEDs作用不明显,统计学无差异。5.在益心解毒方药理机制研究方面,血液指标检测结果显示：益心解毒方具有显著抑制炎症反应及氧化应激损伤的心肌保护作用。在炎症因子表达方面,给予益心解毒方治疗28 d后,血清中炎症因子如]NF-α, IL-6水平明显下降；而循环中丙二醛(Malondialdehyde, MDA)水平下降,并且具有心肌保护作用的超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)水平升高,说明益心解毒方对心肌缺血引发的氧化应激损伤抑制作用显著。心肌组织指标检测结果显示：益心解毒方能够有效抑制心肌细胞的纤维化,逆转心室重塑过程,如MASSON染色结果显示益心解毒方有效抑制心衰大鼠心肌细胞间质的纤维增生,同时IHC结果显示益心解毒方组大鼠的心肌组织中I/III型胶原(CollangeⅠ/Ⅲ,CI/Ⅲ)表达显著下调；同时反映心肌肥厚及心肌重塑的超声指标LVEDd. LVEDs以及心脏体重指数均有好转,故改善心衰后心室重塑是益心解毒方治疗心衰的核心机制。益心解毒方抑制心室重塑的机制主要与以下几个环节有关,其中包括抑制心肌缺血引发的心肌组织中炎性因子(TNF-α、IL-6)的浸润,抑制氧化应激损伤反应(升高SOD,降低MDA),降低心肌组织基质中MMP9、MMP2以及转化生长因子-β(Transforming growth factor-beta, TGF-β)的表达；下调心肌细胞中血管紧张素Ⅱ1型受体(AngiotensinⅡreceptorl, AT1)的表达；并且能够显著下调心肌组织中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH)的亚型NOX2、NOX4的表达,并抑制信号通路转导蛋白STAT3、NFκB的表达；6.从中药成分与结构出发预测药物靶标,发现该复方的药理机制主要集中于神经内分泌环节、氨基酸代谢、能量代谢等过程,从中挑选最有可能成为靶标的肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosterone system, RAAS)进行研究,并通过动物模型的建立以及药物的干预进行实证。事实证明,益心解毒方能够有效且作用明确的降低心肌与循环中的肾素(renin,Ren),AngⅡ,AT1R水平,同时也证明了中药的多靶点调控机制。结论1.利用左冠状动脉结扎术制备的心肌缺血心功能不全动脉模型在术后60天内表现为“气虚→气虚血瘀→气虚”的证候演变规律；而TNF-α持续高表达,通过介导炎症以及心室重塑等不同病理过程参与了心肌缺血心功能不全的证候演变。2.在心肌缺血心功能不全的“气虚→气虚血瘀→气虚”的证候演变过程中,大鼠血清代谢物发生了特征性的变化；心肌缺血心功能不全疾病状态下,糖、脂、氨基酸类代谢障碍,最终导致的TAC通路异常,是心肌缺血心功能不全进行性恶化与转归的基础,其中柠檬酸、葡萄糖苷、乳酸、棕榈酸等特定分子异常表达可能成为心肌缺血心功能不全临床诊断与治疗的靶标。此外,通过数据挖掘方法寻找不同证候代谢物之间特定的组合模式,可用于临床心肌缺血证候的诊断与中药疗效的评价中。3.通过益心解毒方干预心肌缺血心功能不全气虚血瘀证大鼠模型的实验研究发现,益心解毒方的药效作用除能改善大鼠心功能、血流动力学各项指标以及具有降低各类心肌酶等心肌保护作用外；还能够改善诸如大鼠呼吸运动、爪等皮肤紫暗等表征层面的指标,进而减轻心功能不全大鼠气虚血瘀证的程度。4.建立心肌缺血气虚血瘀证的以NADPH氧化酶为核心的活性调控机制网络,通过益心解毒方的干预,证明该复方的网络调控作用的发挥有赖于对以NADPH氧化酶为核心的RAAS、MMPs网络平衡以及氧化应激损伤三大机制激活的抑制作用的发挥。5.通过生物信息学与实验验证相结合的方式,针对基于中药复方复杂成分靶标预测体系,确立中药复方药效作用的分子机制。以治疗心肌缺血确有疗效的益心解毒方为例,阐明该方剂作用与RAAS的多靶点、多途径作用机制。通过此项研究,有望建立一种可靠的、有效的针对中药复方复杂、多靶点作用机理的药理药效研究方法。