氯胺酮是短小外科手术的常用麻醉药,也经常用于小儿麻醉,近些年来非法使用氯胺酮以及氯胺酮成瘾的案例逐渐增加,有必要对氯胺酮的代谢机制和影响因素作进一步的研究和探讨。Yanagihara等人在检测是何种细胞色素酶催化氯胺酮对映体N-去甲基化作用的实验中发现,与其它CYP相比,CYP286催化氯胺酮N-去甲基化的Km最小,而且奥芬那君（CYP286的免疫抑制剂）能够同时抑制两种对映体N-去甲基化作用的60%-70%,所以认为人肝脏微粒体中氯胺酮的N-去甲基化主要是由CYP286催化。而Youssef等人的研究指出P450CYP286、CYP3A4、CYP2C9三种酶同时代谢氯胺酮,CYP3A4占主导地位,而CYP286仅占很小一部分,究竟有几种P450酶参与氯胺酮的代谢和哪一种酶起到决定性作用目前还没有定论。在人类P450家庭中,主要自3族（CYP1,CYP2,CPY3）19种同工酶参与外来化学物的代谢。现已清楚细胞色素P450系统和肝脏代谢有关。CYP1,2,3家族约占肝P450总含量的70%,并负责大多数药物的代谢。已知CYP2C9、CYP286、CYP3A4三种酶在肝微粒体中具有较高活性。CYP2C9能代谢和活化许多种药物、前致癌物、前毒物和致突变剂,催化约12%的临床常用药物。遗传多态性、酶抑制、酶诱导及生理因素均可引起细胞色素P450活性的改变,这有一定的临床含意。因为这会引起药物药代动力学的改变,导致药物效能改变,因代谢减少或毒性代谢物生成增多而增加药物毒性,以及导致药物的相互作用。CYP2C9基因位于染色体10q24.2上,全长为55kb,包括9个外显予,8个内含子,编码490个氨基酸残基。在CYP2C9的开放读码区存在着12种基因多态性[CYP2C9*1至CYP2C9*12],CYP2C9,3是由于C1075代替A,Ile359（ATT）→Leu359（CTT）氨基酸的改变,此突变可导致Nsi I位点的丢失。CYP2C9*2、CYP2C9*4、CYP2C9*5、CYP2C9*6均不存在于健康中国人。随着CYP2C9分子药理学的深入研究,将从基因水平阐述CYP2C9的表达调控机制,及其个体差异性的产生机理。本研究主要是通过应用特异性底物和酶抑制剂证实CYP2C9对氯胺酮的催化作用,并筛查CYP2C9基因多态性,探讨不同基因型的个体对P450酶含量以及CYP2C9酶活性的影响和对氯胺酮催化作用的差异。这一研究对阐明氯胺酮的代谢机制和预测氯胺酮代谢的个体差异具有重要的临床意义。目前国内外还没有相关报道。实验材料一、实验主要试剂和药品氯胺酮标准品（上海邦宇生物科技有限公司,含量99.99%）布比卡因标准品（上海邦宇生物科技有限公司,含量99.99%）磺胺苯吡唑标准品（Sigma公司,美国,含量99.9%）甲苯磺丁脲标准品（Sigma公司,美国,含量99.9%）DNA提取试剂盒购自美国GENTESTPCR引物、PCR所需试剂等均购自上海生工生物工程技术有限公司MAKER购自大连宝生物公司NSiI购自华美生物公司二、实验主要仪器器材HP1160型高效液相色谱仪（美国惠普公司）G1311型四元泵（美国惠普公司）G1314A型紫外检测器（美国惠普公司）G1322A型真空脱气机（美国惠普公司）G1316A型柱温箱（美国惠普公司）Hypersil ODS2色谱柱（4.6mm×150mm,5μm,大连依利特）UV300紫外可见光分光光度计（Pye-unicam/spectronic,英国）Power Pac 1000电泳仪（Bio-Rad,美国）Gene Amp PCR System 9700 PCR仪（Perkin-Elmer,美国）BIS 303PC电泳凝胶成像系统（DNR,以色列）实验方法一、CYP2C9对氯胺酮代谢的催化作用本研究进行人体组织实验已获得中国医科大学伦理委员会的批准。20例人体肝脏组织分别来自中国医科大学附属第一医院、中国医科大学附属盛京医院和沈阳军区陆军总院普外科肝脏部分切除手术,取直径为1～2cm的正常肝脏组织（经病理形态学证实）,10 min内液氮冰冻,—70℃冰箱保存备用。肝脏微粒体通过差速离心法制备,微粒体部分重悬于含有20%（v/v）甘油的磷酸钾缓冲液中,—70℃冰箱保存。以牛血清白蛋白做标准曲线,应用改良的Lowry’s法测定微粒体内的蛋白含量。孵育条件:孵育混合液包括0.4mg/ml微粒体稀释液,100mM磷酸钾缓冲液（PH7.4）和在聚乙烯试管中孵育过的0.5mL底物,37℃水浴摇床先预孵育3min,反应从加入1mM NADPH辅酶再生系统（0.5 mmol/L NADP⁺,5 mmol/L G6P,2 unit/ml G6PDH,6 mmol/L MgCl₂）开始,分别孵育0,5,10,20,40,60min。各管中加入lml 0.1M的冷NaOH放入-20℃冰箱中止反应。采用高效液相色谱法（HPLC）测定各时点氯胺酮的浓度。与CYP2C9的特异底物甲苯磺丁脲和抑制剂磺胺苯吡唑作相关分析。荧光检测波长为211 nm,流速lml/min,流动相:乙腈:0.025mol/l KH₂PO₄:三乙胺（40:60:0.02）二、CYP2C9基因多态性对P450酶含量和CYP2C9活性的影响203例病例分别来自中国医科大学附属第一医院、中国医科大学附属盛京医院和沈阳军区陆军总医院2006年1月至2007年1月期间普外科行肝脏部分切除手术的患者,汉族,静脉采血2ml用于DNA提取以及基因型测定。筛选出的不同基因型患者（CYP2C9野生型和突变体）,比较肝微粒体内P450酶的含量和对CYP2C9活性探针甲苯磺丁脲的代谢速率的影响。三、CYP2C9基因多态性对氯胺酮药代动力学的影响203例病例来源和基因分型工作同实验二。筛选出不同基因型患者（CYP2C9野生型和突变体）,比较肝脏微粒体氯胺酮的代谢速率。肝脏微粒体代谢氯胺酮的方法同实验一。四、药代动力学分析及统计学处理数据以（?）+SD表示。肝脏微粒体中氯胺酮的代谢速率可通过下面公式计算,其中C为氯胺酮在孵育液中的初始浓度,t_1/2为氯胺酮在孵育液中的消除半衰期:消除速度R=C×0.693/t_1/2,氯胺酮消除半衰期是从各时间点氯胺酮剩余浓度的均值对时间作半对数图形进行线性相关分析计算而得。数据处理采用SPSS11.5。不同基因型组间P450酶含量和氯胺酮代谢速率的比较采用配对t检验。P＜0.05认为差异有显著性。结果一、肝脏微粒体体外孵育氯胺酮各时点氯胺酮浓度的测定HPLC结果表明,在实验测定范围内,进样量与峰面积呈良好的线性关系。在本实验条件下,氯胺酮及内标布比卡因分离完全,不受微粒体孵育液中内源性物质的干扰。其保留时间分别为3.4min和5.8min。检测精密度、准确度、提取回收率均符合生物样品检测要求。二、氯胺酮代谢速率的测定20例人肝脏微粒体中氯胺酮的代谢速率相差最大约一倍（5.4-11.2）,平均为8.2nmol·min^-1·mg^-1protein（7.3-10.8）。该速率与CYP2C9活性探针甲苯磺丁脲代谢速率呈明显相关性（γ=0.886,P＜0.01）。加入特异性抑制剂磺胺苯吡唑组,氯胺酮的平均代谢速率都明显低于正常孵育对照组（P＜0.01）,为5.4nmol·min^-1·mg^-1protein（4.97～5.89）,抑制率为33.6%。三、CYP2C9基因分型所有样本PCR扩增产物均为一长度170bp的特异性片段。CYP2C9突变型的PCR产物有一个NSiI的酶切位点,经酶解后被切成140bp和30bp两个片段。野生型则不能被切开。203例基因分型检出野生型196例,突变型杂合子7例,突变型纯合子未能检出。四、CYP2C9基因多态性对P450酶含量的影响P450含量测定范围符合测定标准0.4-1.0nmol/mg。7例野生型个体和7例突变型个体组平均P450酶含量分别为0.8 Inmol/mg和0.76nmol/mg,两组比较没有统计学差异。（P＞0.05）五、CYP2C9基因多态性对CYP2C9酶活性的影响7例野生型个体和7例突变型个体组甲苯磺丁脲的代谢速率分别为1.7nmol·min^-1·mg^-1protein和0.6nmol·min^-1·mg^-1protein,两组比较有显著性差异。（P＜0.01）六、CYP2C9基因多态性对氯胺酮代谢速率的影响7例野生型和7例突变型个体组氯胺酮的代谢速率分别为7.9nmol·min^-1·mg^-1protein（7.1-9.8）和5.3nmol·min^-1·mg^-1protein（4.8-6.2）,两组比较有显著性差异。（P＜0.05）讨论本研究的结果提示CYP2C9参与了氯胺酮的代谢,CYP2C9特异性抑制剂磺胺苯吡唑抑制了氯胺酮的代谢。既往文献报道了多种检测氯胺酮血药浓度和尿液浓度的方法,但是在肝微粒体孵育液中的氯胺酮浓度测定目前国内还没有相关报道。本研究所建立的检测人肝微粒体孵育液中氯胺酮浓度的HPLC法,氯胺酮和内标布比卡因峰型良好,分离度较好,微粒体中其他杂质干扰性很小。达到了生物样本分析的要求。是体外模拟氯胺酮代谢的可靠研究手段之一。大量研究表明,CYP2C9在人类存在几种等位基因突变体。其中最主要的有三种,即野生型（CYP2C9^*1）、R144C突变体（CYP2C9^*2）和I359L突变体（CYP2C9^*3）,并已在不同的种族得到证实。为探明CYP2C9遗传多态性的分子机制,Wang等人（1996）利用PCR-核酸内切酶消化法检测CYP2C9 cDNA中的点突变,结果显示:CYP2C9共有4个点突变,第一和第三个点突变,分别表示为R144C（CYP2C9^*2）和1359L（CYP2C9^*3）,它们在人群中具有一定的发生频率并具有种族差异,其中白人稍高于亚洲人。CYP2C9基因第7外显子上Nsi I位点呈现多态性（Ile359 u）。如果表达第359位氨基酸密码子的第一碱基C置换为A,则失去了Nsi I酶切位点。第359位氨基酸为异亮氨酸（Ile）,参与该酶的活性中心构件。亮氨酸（Leu）替代异亮氨酸（Ile）,改变了酶结构,从而降低了酶的催化能力。药物遗传学研究能增加药物治疗的安全性和有效性,减少不良反应的发生,有利于个体化,预测性和预防性治疗,但尚无有关药物遗传学检测的经济学以及对患者预后的大规模研究,而此恰恰为确保患者最大受益、降低相关医疗费用所必需。因此,进行不同基因型患者群的成本对比研究,是确定何种情况下的基因分型更能降低医疗成本的最有效方法。而且,仅在实施者有足够证据表明药物遗传学检测能降低成本、提高疗效时,才更有临床和实际意义。结论1、CYP2C9对氯胺酮代谢具有催化作用,其抑制剂使氯胺酮的代谢速率减慢。2、CYP2C9基因多态性对肝微粒体P450酶含量没有显著影响,CYP2C9基因多态性降低了CYP2C9的酶活性。3、CYP2C9基因多态性对氯胺酮代谢动力学具有显著影响,检测突变型个体对指导临床合理用药和个体化医疗具有重要意义。