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研究背景与目的磷酸二酯酶基因家族(PDE family)在体内广泛分布,有11种亚型。PDE家族的主要功能是水解细胞内的第二信使3’,5’-环状腺苷酸(cAMP)口(或)3’,5’-环状鸟苷酸(cGMP),继而影响其下游蛋白激酶活性,从而调控各种生物学效应。目前,作用于PDE的药物如磷酸二酯酶抑制药已在临床上广泛应用,如治疗心血管疾病、肺动脉高压、勃起功能障碍和哮喘等。在全球范围内,心力衰竭(Heart Failure,HF)是威胁人类健康和增加医疗负担最主要的疾病之一。有研究发现,内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ER stress)在心力衰竭病人的心肌中被激活,并被证明是心力衰竭发生和发展的重要机制。不仅如此,有研究发现特异性水解cGMP的5型磷酸二酯酶(PDE5)在心力衰竭的病人心肌中表达明显升高。5型磷酸二酯酶的抑制剂具有明显的抗心肌肥厚和心力衰竭的作用。而在心肌肥厚及心力衰竭中,5型磷酸二酯酶与内质网应激的关系目前尚无报道。本研究通过使用人的心力衰竭的组织标本、心力衰竭的动物模型以及相关的细胞实验研究5型磷酸二酯酶与内质网应激的关系。实验方法与结果首先,我们在人的心力衰竭的组织标本中寻找5型磷酸二酯酶与内质网应激的关系。本实验用到了4例因扩张型心肌病行心脏移植术的心脏标本、6例因心力衰竭行二尖瓣置换术的心脏标本,以及4例因交通事故死亡的正常心脏标本。应用Western blotting的方法检测这些组织标本中内质网应激的激活状态和PDE5的表达。结果显示,内质网应激的效应分子,包括P-PERK、GRP78、XBPls和CHOP,在心力衰竭的组织样品中表达都显著升高。有趣的是,我们还发现PDE5在衰竭的心脏组织中的表达也明显升高,并且PDE5高表达的程度与内质网应激标志物表达增加的程度明显相关。由此说明,在心力衰竭中PDE5的表达与内质网应激可能存在相关关系。随后,我们用异丙肾上腺素(isoproterenol,Iso)和胸主动脉缩窄术(transverse aortic constriction,TAC)建立了两种心力衰竭的动物模型。通过形态学、血流动力学和心脏超声检测,发现PDE5抑制剂能够明显缓解Iso和TAC诱发的心肌肥厚和心力衰竭。为进一步研究抑制PDE5是否能够缓解心力衰竭中的内质网应激,本实验检测了动物模型中内质网应激的标志物。结果发现,PDE5抑制剂(西地那非)明显地缓解心力衰竭中内质网应激标记物的高表达。严重或长期的内质网应激触发细胞凋亡,这被认为是内质网应激导致心力衰竭的关键机制。为此,本实验检测了内质网应激特异的凋亡蛋白C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)的表达和心力衰竭中凋亡细胞的数量。研究结果表明,在心力衰竭动物模型中,PDE5抑制剂能够明显抑制CHOP的表达和心肌细胞的凋亡。为进一步明确抑制PDE5对内质网应激的作用,我们用Iso、毒胡萝卜素(thapsigargin,TG。TG是一种内质网膜钙泵抑制剂。它可以促进内质网腔内钙清空导致内质网应激,是特异性的内质网应激刺激剂。)和西地那非干预H9c2(2-1)心肌细胞。结果显示,在体外实验中抑制PDE5同样可以缓解内质网应激以及其介导的心肌细胞凋亡。此外,我们还研究了蛋白激酶G(PKG)在PDE5抑制剂抗内质网应激中的作用。结果显示,PKG的抑制剂KT5823和DT3部分扭转了PDE5抑制剂西地那非在心肌细胞中的抗内质网应激作用。这提示PKG途径部分参与了PDE5抑制剂对内质网应激的保护作用。肌浆网钙调节蛋白和细胞内钙稳态与内质网应激密切相关。因此,我们在心力衰竭动物模型中检测了肌浆网钙调节蛋白肌浆网(内质网)钙泵2a(sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase2a,SERCA2a)和受磷蛋白(phospholamban,PLB)的表达。结果显示,抑制PDE5扭转了心力衰竭动物模型心肌中SERCA2a和磷酸化的PLB(P-PLB)的表达下调。这提示,PDE5抑制剂可能是通过对SERCA2a和P-PLB表达的调控从而发挥其抗内质网应激的作用。为进一步明确其具体作用机制,本研究运用PLB的野生型质粒和突变型质粒(16位丝氨酸→丙氨酸)确定PLB16位丝氨酸在PDE5抑制剂抗内质网应激效应中起关键作用。结论综上所述,在心力衰竭的动物模型中特异性抑制PDE5可以明显改善心脏功能,并且能够明显缓解心力衰竭中的内质网应激。抑制PDE5治疗心力衰竭的机制可能是通过其抗内质网应激的作用实现的。这为PDE5抑制剂用于心力衰竭的治疗提供了新的理论依据,也为心力衰竭的治疗提供了新的思路。