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肺癌的早期诊断和治疗成为临床上一大难题。随着分子生物学技术的飞速发展,研究癌症的基因发病机制、基因诊断和基因治疗受到大家的关注。近期研究已表明肺癌细胞中常存在DNA甲基化状态的改变,DNA异常甲基化是一种表观遗传(epigenetic)改变而非基因水平改变。这种现象不仅可以激活原癌基因的表达,而且可使一些抑癌基因转录功能失活。中国医学科学院基础研究所生化实验室新发现的基因NECL2在多种肿瘤中表达下降或失活,国外报道与启动子区甲基化相关,用去甲基化试剂处理的一些肿瘤细胞系中,NECL2的表达水平恢复到正常,这提示NECL2启动子区的甲基化可能是导致NECL2表达下调的原因。考虑到NECL2在肿瘤抑制的过程中有着重要作用,并依据启动子区甲基化与NECL2表达下调相关的线索和甲基化可逆性特征.本文在对感兴趣的肺癌细胞系中,初步研究了NECL2的表达调控机制。首先,我们在一例正常脑组织和三种肺癌细胞系(A549、NCI-H446、Calu-3)中检测了NECL2的表达谱,运用bisulfite sequencing(亚硫酸氢盐修饰后测序)和甲基化酶抑制剂5-AzaC处理方法得知,NECL2在肺癌细胞系中的表达缺失是由启动子区的甲基化引起,去甲基化使NECL2恢复表达,DNA甲基化检测及DNA甲基化的可逆性特征为临床肿瘤诊断和治疗提供了依据。下一步,根据生物信息学分析的结果,构建了人NECL2基因5’非编码区系列缺失报告基因质粒,应用双荧光素酶报告基因实验,推测人NECL2的核心启动子区可能位于ATG上游的—68到—329区域内。我们克隆了Spl的编码区序列,构建了带V5标签的Spl真核表达质粒,与带有人NECL2基因核心启动子区的报告基因质粒共转染A549和NCI-H446细胞,以检测Sp1对人NECL2启动子的转录活性的影响。应用双荧光素酶报告基因实验,我们发现在肺癌细胞中,过表达外源性Sp1对人NECL2启动子的转录活性无明显影响。最后,用化疗药顺铂处理体外培养的A549和NCI-H446细胞,用流式细胞仪检测了处理后细胞发生的变化,结果表明,顺铂可能是通过破坏细胞周期和引起细胞凋亡而杀死肺癌细胞,可以为以后的深入研究提供一点线索。综上所述,本文通过bisulfite sequencing和5-AzaC处理实验,再次验证了NECL2在肺癌细胞中的表达缺失是由启动子区的甲基化引起。DNA甲基化程度检测可能成为癌症早期诊断的分子标志物,DNA甲基化的可逆性特征为临床抗肿瘤治疗提供了一种新途径。通过双荧光素酶报告基因实验,首次推测了人NECL2可能的核心启动子区,并对转录因子Sp1对人NECL2启动子转录活性的影响进行了初步分析,为阐明人NECL2的表达调控机制奠定了基础。