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为寻找基因水平治疗鸭甲肝病毒(DHAV)的可行性靶位点,我们对DHAV的内部核糖体进入位点序列(Internal Ribosome Entry Site, IRES)元件设计合成了6条(DZ369、DZ454、DZ514、DZ454-7、DZ454-9和DZ000)脱氧核酶(DNAzyme),开展了DNAzyme对IRES元件切割、对DHAV复制的抑制作用研究,获得如下结果。以构建的pGEM-T/IRES质粒为模板,通过T7体外转录试剂盒进行体外转录得到含有IRES结构元件的RNA单链产物(DHAV-RNA),长度约为361m,在金属离子Mg2+存在的情况下,DHAV-RNA与DNAzyme进行相互作用后5.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测,结果显示具有完整的酶切活性中心和与底物完全互补配对的侧翼结构的DZ369、DZ454和DZ514均能在靶RNA的G-C或者A-C位点进行切割反应,而只有完整酶切活性中心不具备切割底物的识别结构域的无关对照组DZ000,不能对靶RNA进行有效切割,表明DNAzyme对IRES的切割反应具有很强的特异性。DNAzymes需要二价金属离子的辅助才能更好地发挥作用,并且在不同金属离子的作用下,DNAzymes对IRES表现出不同的切割活性,其中Mg2+对DNAzymes的活性表现出最强的促进作用,其余依次是Zn2+、Mn2+、Ni2+和Co2+。将含有IRES结构元件的目的基因和Red基因克隆到pEGFP-N1中,得到双表达载体pEGFP-Red-IRES-N1并转染DEF细胞中,成功表达出Red和EGFP荧光蛋白。与阳性对照组相比,重组克隆载体的绿色荧光蛋白的表达量只能到达对照组的60-65%,且IRES依赖性的EGFP开始表达的时间比帽子依赖性的时间更延后,说明IRES能起始其下游基因的表达,但是活性没有CMV启动子的强。随后将双表达载体pEGFP-Red-IRES-N1和DNAzyme共转染DEF细胞,发现转染DNAzyme的试验组中EGFP表达受到了抑制,最强抑制作用出现在10μmol/L的DZ454组,而DNAzyme侧翼长度的改变没有影响其活性。与对照组相比Red蛋白的表达量没有差异,表明IRES起始的蛋白的表达是相对独立的。另外一个重要的结果是在DZ454对DHAV-1全病毒复制的抑制作用的试验中,用一步荧光定量RT-PCR(FQRT-PCR)的方法检测细胞碎片中不同时间点3D基因的表达情况。结果显示,到第60 h时病毒的复制量达到最大值,之后保持不变,且在病毒复制的整个过程中DZ454通过对IRES的剪切而发挥对DHAV-1复制的抑制作用,在第72 h时抑制率达到了最大值(10.38%),之后保持不变。综上,在有二价金属离子的参与下,DNAzyme能对DHAV的IRES的特定位点进行有效切割,在DEF中也对DHAV复制表现出了一定的抑制作用,结果为进一步探索DHAV感染的治疗提供了可参考的数据。