植病生防菌哈茨木霉(Trichoderma harzianum)的研究

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本文从台湾地区不同市县的13份土壤标本中分离到一株对镰刀菌有较强抑制作用的木霉生防菌,经鉴定为哈茨木霉,命名为FJAT-9040。本文研究了不同碳源、氮源、碳氮比、无机盐以及不同培养条件如培养时间、接种量、初始pH值、温度等对FJAT-9040菌丝生长和产孢量的影响,探讨了FJAT-9040菌丝生长及产孢与其菌体脂肪酸种类及含量的之间的相关性,测定了哈茨木霉菌株FJAT-9040对四株不同寄主的镰刀菌的抑制作用,构建了哈茨木霉的gfp基因遗传转化体系,成功获得了一个gfp基因标记的哈茨木霉菌株,命名为FJAT-9295,研究了该菌株在不同的土壤类型中的定殖特性及其对土壤微生物群落结构的影响,结果如下:FJAT-9040的最佳碳源为葡萄糖、最适氮源为牛肉浸膏,碳氮比以3:1为最好,最适无机盐为硫酸镁。经正交优化确定FJAT-9040的最适固体培养基组成合为:葡萄糖18 g、NaNO3 16.6 g、MnSO4 1 g、KH2PO4 2 g、水1000 mL。FJAT-9040的最佳培养条件为:培养3天最利于菌丝生长,4天产孢量最大,接种量以1%为最好;初始pH值为4-6时菌丝生长好,pH值为6-8时,产孢量最大;25℃为最适菌丝生长温度,最佳产孢温度为30℃。不同的营养条件能够引起哈茨木霉脂肪酸种类和含量的改变,但四种主要脂肪酸的含量均表现为:C18:2ω6,9c/18:0 ANTE > C16:0 > C18:1ω9c > C18:0。不同营养条件下的哈茨木霉经聚类分析聚成五个类群,结果表明不同类群的处理之间平均脂肪酸含量、种类、及主要脂肪酸的含量差异与哈茨木霉的菌丝生长及产孢情况具有一定的相关性。C18:2ω6,9c/18:0 ANTE脂肪酸的含量与菌丝生长和产孢密切相关。哈茨木霉菌株Trichoderma harzianum FJAT-9040对四株枯萎病病原菌FJAT-136、FJAT-141、FJAT-282、FJAT-370抑制率均在80%-90%之间。当镰刀菌孢子浓度为107个/mL时,抑菌圈直径分别为16.00 mm、27.9 mm、16.78 mm、14.54 mm。FJAT-9040的代谢液造成了镰刀菌菌丝发生扭曲、变细、原生质体膨大、浓缩、菌丝内出现大液泡等畸形。FJAT-9040的抑菌作用主要是通过竞争和抗生作用实现的。通过PEG-CaCl2介导的原生质体法构建了哈茨木霉的GFP转化体系,成功地将携带潮霉素B抗性基因和gfp标记基因的质粒pCT74整合到哈茨木霉的染色体上,获得一株荧光强度高,遗传稳定的转化菌株FJAT-9295,其菌丝生长的生物量和产孢量与野生型相比略有降低,抑菌能力略有降低,但抑菌效果仍显著。采用gfp基因标记的FJAT-9295哈茨木霉菌株研究了在不同土壤中的定殖特性,结果表明,哈茨木霉菌株FJAT-9295在不同类型的土壤中的定殖情况不同,定殖难易程度依次为沙土>营养土>黄土>菜园土。木霉定殖的前15天,在有植株的情况下定殖数量显著高于无植株的,16天后这种优势力逐渐降低,32天后趋于稳定,数量约为105个/mL。PLFAs分析结果表明:FJAT-9295能够明显地抑制土壤中细菌、真菌、放线菌等微生物的生长,从而改变土壤的微生物群落结构。
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