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Nodal属于TGF-β超家族细胞分泌因子,在其经典的信号转导过程中,Nodal首先与II型膜受体ACTRII或ACTRIIB结合,然后招募并激活I型膜受体ALK4或ALK7,激活的ALK4或ALK7使胞内Smads被磷酸化并转位入核以调节靶基因表达。Nodal分子最初发现在胚胎发育过程中发挥作用,最近又发现它具有促肿瘤功能,但相关分子机制有待阐明。特别是由于TGF-β超家族成员中同一配体可以识别不同受体和同一受体结合不同配体,至今不清楚Nodal及其受体ALK4或ALK7在肿瘤中的相互关系和功能地位。乳腺癌是女性中发病率最高,死亡率居第二位的恶性肿瘤,特别是我国的乳腺癌发病率呈逐年增加趋势。本文主要探究Nodal及其受体ALK4和ALK7在乳腺癌发生发展过程中的表达意义、相互关系和功能。研究内容包括:⑴免疫组织化学方法检测Nodal及其受体ALK4和ALK7在浸润性导管癌、淋巴结转移、导管原位癌、癌旁组织、纤维腺瘤和腺病等6种不同类型组织中的表达,进一步用Western Blotting比较新鲜浸润性导管癌及其配对癌旁组织中这三种蛋白分子的表达。⑵分析Nodal、ALK4和ALK7三种蛋白在浸润性导管癌组织中的表达与临床病理指标之间的关系,应用Spearman等级相关性分析揭示它们在导管原位癌、浸润性导管癌和淋巴结转移组织中表达的相关性。⑶在上述基础上,明确Nodal在乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭中的功能及其相关分子机制。⑷通过过表达和组成性激活方法揭示ALK7对乳腺癌细胞增殖的影响。本文的主要研究结果总结如下:1.Nodal蛋白在癌旁、腺病、纤维腺瘤、导管原位癌、浸润性导管癌、淋巴结转移等6种乳腺组织中的阳性表达率分别为22.9%、34.6%、13.0%、34.1%、66.1%和40.4%;在浸润性导管癌组织中Nodal阳性表达率显著高于癌旁组织(P﹤0.001)、腺病(P=0.003)、纤维腺瘤(P﹤0.001)、导管原位癌(P=0.001)和淋巴结转移组织(P=0.001);在淋巴结转移组织中Nodal阳性表达率显著高于纤维腺瘤(P=0.018),其它各组织类型之间表达无显著性差异。在原发浸润性导管癌中Nodal蛋白阳性表达率高于配对淋巴结转移组织(P=0.017)。Western Blotting结果同样表明在浸润性导管癌中Nodal蛋白表达高于配对癌旁组织。在浸润性导管癌组织中Nodal蛋白表达与年龄分组(P=0.043)、肿瘤组织学分级(P=0.001)和临床分期(P=0.035)密切相关,即Nodal蛋白分别在低年龄组、肿瘤分化程度低组和临床分期晚组阳性表达率高,而与肿瘤大小、淋巴结转移、雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)状态无关。2.alk7蛋白在癌旁、腺病、纤维腺瘤、导管原位癌、浸润性导管癌、淋巴结转移等6种乳腺组织中的阳性表达率分别为81.6%、85.0%、82.1%、50.0%、24.6%和20.0%;在导管原位癌组织中alk7阳性表达率显著低于癌旁组织(p=0.006)、腺病(p=0.002)和纤维腺瘤(p=0.005),但高于浸润性导管癌(p=0.004)和淋巴结转移组织(p=0.004);在浸润性导管癌和淋巴结转移组织中alk7蛋白阳性表达率除低于导管原位癌外,还分别显著低于癌旁组织(p﹤0.001)、腺病(p﹤0.001)及纤维腺瘤(p﹤0.001);其它各组织类型之间表达无显著性差异。alk7蛋白在原发浸润性导管癌和配对淋巴结转移中表达一致。westernblotting结果确认浸润性导管癌中alk7蛋白表达明显低于配对癌旁组织。在浸润性导管癌中alk7蛋白表达与肿瘤组织学分级(p=0.028)和临床分期(p=0.005)密切相关,即alk7蛋白阳性表达率在低分化组中分别低于高、中分化组,分别在临床分期Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期组低于Ⅰ期组;alk7蛋白表达与年龄、肿瘤大小、淋巴结转移、er和pr状态无关。3.alk4蛋白在癌旁、腺病、纤维腺瘤、导管原位癌、浸润性导管癌、淋巴结转移等6种乳腺组织中的阳性表达率分别为100.0%、92.3%、95.7%、92.9%、69.1%和73.5%;在浸润性导管癌组织中alk4蛋白阳性表达率显著低于癌旁组织(p﹤0.001)、腺病(p=0.014)、纤维腺瘤(p=0.008)及导管原位癌(p=0.009);在淋巴结转移组织中alk4蛋白阳性表达率显著低于癌旁组织(p=0.001)、腺病(p=0.043)、纤维腺瘤(p=0.026)及导管原位癌(p=0.038);其它各组织类型之间表达无显著性差异。与alk7类似,alk4在原发浸润性导管癌与配对淋巴结转移中表达一致。westernblotting结果同样发现在浸润性导管癌中alk4蛋白表达低于配对癌旁组织。在浸润性导管癌中alk4蛋白表达与肿瘤组织学分级(p﹤0.001)、er(p﹤0.001)及pr(p=0.001)状态有关,即alk4蛋白阳性表达率在低分化组低于高、中分化组,er和pr阴性组低于阳性组;alk4蛋白表达与年龄、肿瘤大小、临床分期、淋巴结转移状态无关。4.在低表达nodal的低侵袭性乳腺癌细胞t47d中稳定表达nodal基因后可促进细胞上皮-间质转化。另一方面,应用nodal受体抑制剂sb-431542处理高表达nodal的高侵袭性乳腺癌细胞bt-549,可抑制细胞增殖、迁移和侵袭,并证明可能与抑制基质金属蛋白酶mmp-2的表达和活性有关。5.应用基因定点突变产生的组成性激活alk7-ca可抑制乳腺癌细胞增殖,在低表达alk7的乳腺癌细胞中过表达alk7可恢复activinb抑制乳腺癌细胞增殖的作用。6.spearman等级相关性分析结果表明在导管原位癌中nodal与alk4的表达负相关(r=﹣0.378,p=0.047),在浸润性导管癌中alk4和alk7表达正相关(R=0.205,P=0.009),在淋巴结转移中这三种蛋白均无相关性。本文首次系统地分析了Nodal及其受体ALK4和ALK7三种蛋白质在不同类型乳腺组织中的表达、临床意义及其表达相关性,相应功能得到初步揭示。Nodal在浸润性导管癌中高表达,且随乳腺癌分化程度越低或临床分期越晚,Nodal蛋白阳性表达率则更高;体外实验也证实Nodal具有促乳腺癌功能,提示Nodal在乳腺癌中表达增加与乳腺癌的进展相关,可能作为乳腺癌诊断的标志分子和治疗靶点。此外,Nodal受体ALK4和ALK7在乳腺癌发展过程中分别有不同程度降低,特别是低分化乳腺癌中阳性表达率更低;相关性分析表明Nodal与受体ALK4或ALK7分别在浸润性导管癌和淋巴结转移中表达无相关性,提示ALK4或ALK7在乳腺癌中表达降低与乳腺癌的进展相关,也可能作为乳腺癌诊断的标志分子,但它们与Nodal促肿瘤作用的关系有待进一步研究。