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目的：脊髓损伤(Spinal cord injury, SCI)是中枢神经系统的严重创伤,导致受伤部位以下的感觉和运动神经功能的不可逆的损伤。其病理生理具有复杂多变的特性,迄今为止,无有效治疗脊髓损伤的药物,使之成为一个关乎公众健康的重要问题。本课题将研究脊髓损伤后的神经细胞损伤的病理生理机制并寻找可能的治疗靶点,探索新的有效的治疗药物和方法,以便为更好的保护损伤后的脊髓及功能恢复奠定基础。方法：本课题利用大鼠作为动物模型,采用背侧脊髓撞击方法(Allen’s),制作大鼠脊髓损伤的动物模型并用以研究。作为RIP1的特异性抑制剂,Necrostatin-1 (Nec-1)可以有效抑制细胞程序性死亡。在脊髓损伤前20分钟依次给予不同浓度的Nec-1予以保护,观察其药效。利用TTC染色,研究脊髓损伤后12小时和24小时,Nec-1对损伤脊髓的缺血保护作用及最适剂量。HE染色行病理学检测研究Nec-1对于脊髓损伤后的组织及细胞保护作用。BBB运动功能检测研究Nec-1对于脊髓损伤后的运动功能的恢复作用,ELISA试剂盒检测脊髓损伤后24小时Nec-1对于损伤后的炎性细胞因子的影响。‘TUNEL检测脊髓损伤后12小时和24小时的细胞凋亡情况及Nec-1的抑制作用,并用Western Blot定量检测和IHC定位检测Caspase3、Bax、 Bcl-2和P53的表达,Western Blot定量检测RIP1、RIP3和MLKL的表达情况,判断细胞程序性坏死的发生及Nec-1的抑制作用。为了研究脊髓损伤后线粒体的情况及Nec-1的保护作用,我们使用透射电子显微镜对脊髓损伤后24小时的线粒体亚结构进行了分析,试剂盒检测了脊髓损伤后12小时和24小时的线粒体钙离子浓度,JC-1检测了线粒体膜电位(MMP)。使用HPLC分别检测了脊髓损伤后12小时和24小时胞浆内的细胞色素c与总细胞色素c(含线粒体和胞浆细胞色素c),并计算其比例,还对Nec-1对于ATP生成的影响进行了检测。使用试剂盒检测了脊髓损伤后24小时Nec-1对于线粒体呼吸链复合物Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ的影响及氧化应激产物的影响。对于脊髓损伤后12小时线粒体相关基因Cytochrome b、PGC-1、NRF-1和Tfam及损伤后6小时和12小时线粒体融合基因Mfn1和Mfn2,线粒体分裂基因Drp1和Fis1的表达,也使用了Realtime PCR进行了检测。结果：通过TTC染色,发现Nec-1具有脊髓缺血保护作用,1μl 1μg/μl以上的Nec-1均具有保护作用且保护呈剂量依赖型,超过25μg/jil则差异不大。因此1μl25μg/μl的Nec-1具有最好的保护作用,为最适剂量。之后研究均采用此剂量。病理学检测证实Nec-1对于脊髓损伤后的组织及细胞保护作用。BBB运动功能检测证实了Nec-1对于脊髓损伤后的运动功能的恢复作用。所有实验均未发现Nec-1对于脊髓的毒性,提示其安全性较高。在脊髓损伤的这两个阶段中,继发性损伤是最有破坏性的阶段,抑制或减少脊髓损伤后神经细胞死亡,减轻病理学损伤是治疗脊髓损伤和促进神经功能恢复的最重要因素。Nec-1对于急性损伤后的脊髓具有保护功能,这种保护功能在一定程度上是依赖于其对于脊髓损伤后细胞凋亡及程序性坏死的抑制实现的。脊髓损伤后,Nec-1可以抑制细胞凋亡,下调Caspase3和Bax的表达,而提高Bcl-2的表达,体现了其抑制细胞凋亡的可能的影响因子。这个凋亡的调控过程也许并不依赖于P53介导。Nec-1还可以抑制RIP 1/3- MLKL,既体现了脊髓损伤后存在细胞程序性坏死,也说明了Nec-1具有抑制细胞程序性坏死的作用。除提供细胞能量(ATP)外,线粒体调控细胞生长、分化、信息传递和细胞凋亡。脊髓损伤后线粒体功能障碍可能是诱导继发损伤和神经细胞死亡的关键。脊髓损伤以后线粒体内Ca2+浓度急剧增加,线粒体呈现明显的钙超载,随着大量Ca2+的流入,线粒体的膜稳定性进一步下降,MMP降低,MMP对于维护线粒体呼吸电子链产能ATP的功能是非常重要的。伴随着Ca2+浓度急剧增加,线粒体呼吸电子链也受到破坏,ATP生成降低,导致ROS进一步堆积,从而破坏线粒体的稳定性。脊髓损伤后,随着大量Ca2+的流入,线粒体发生肿胀,从而导致外膜破裂,细胞色素c释放进入胞浆,激活细胞凋亡相关因子和炎性细胞因子,加剧细胞的损伤。损伤还导致细胞色素b明显降低。转录激活因子表达量明显降低。控制线粒体融合的蛋白和控制线粒体分裂的蛋白表达异常。Nec-1干预后,Ca2+的浓度有效降低,MMP显著升高,线粒体呼吸链复合物I得到保护,ATP生成增加,ROS有效的降低,细胞色素c的损伤释放减缓,细胞色素b,也就是：mtDNA的拷贝数在一定程度上升高,转录激活因子PGC-1、NRF-1和Tfam,尤其是PGC-1表达量在一定程度上升高,控制线粒体融合的蛋白Mfn1和Mfn2和控制线粒体分裂的蛋白Drp1和Fisl表达趋于正常。结论：脊髓损伤后不仅存在细胞凋亡,也同样存在细胞程序性坏死。作为细胞程序性坏死抑制剂,Nec-1可以有效改善脊髓损伤后的功能,对于脊髓损伤有很好的保护作用。因此,Nec-1很有可能可以作为一种治疗脊髓损伤的有效候选药物。