金属离子广泛参与机体的代谢调控和酶活性调节等过程,在细胞生命活动中发挥重要作用,其过量或不足均会影响一系列胞内生化反应,甚至导致细胞死亡。生物活性纳米材料介导的离子干扰疗法,是一种借助外源导入或内源消耗金属离子的手段,调控疾病部位的金属离子稳态,改变病变细胞的生理特性,实现治疗疾病的新策略。研究表明,钙、铁、银等离子干扰疗法在抗肿瘤或抗菌领域发挥了重要作用,而作为体内关键辅酶的锌离子却鲜有研究。本论文以恶性肿瘤和耐药菌为模型,构建系列胞内锌离子调控型纳米药物,探索基于纳米药物锌离子干扰疗法在抗肿瘤、抗菌领域的应用。主要研究内容如下:1.刺激响应型锌离子过载纳米药物诱导肿瘤系统性能量耗竭肿瘤饥饿疗法作为一种临床治疗手段受到了广泛关注。目前,饥饿治疗主要通过消耗肿瘤所需的营养成分,或阻塞肿瘤组织部位的血管达到抑制肿瘤生长的目的,然而,现有的饥饿疗法对肿瘤组织的能量封锁不彻底且缺乏特异性,从而引发肿瘤细胞的自适应调节以及正常细胞的严重毒副作用。这些问题严重限制了饥饿疗法的临床应用。本课题提出一种新型饥饿疗法,通过协同锌离子干扰介导的糖酵解抑制和葡萄糖摄取阻断,实现肿瘤特异性的能量耗竭。首先,为了实现显著的胞内锌干扰效果,本课题选择了具有酸响应释放锌离子特性的透明质酸（Hyaluronic acid,HA）修饰的ZIF-8纳米粒（HA/ZIF-8）,作为潜在的锌离子正调控型纳米材料,以期高效诱导肿瘤胞内锌过量。研究发现,HA/ZIF-8可在HA介导的肿瘤靶向作用的协助下,优先诱导恶性黑色素瘤细胞胞内锌过量,并利用锌稳态失衡触发烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+）生成减少,甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）失活,最终导致有效的肿瘤糖酵解抑制。细胞锌离子检测结果表明,恶性黑色素瘤细胞锌含量经HA/ZIF-8处理2 h后从0.89μg/10~6个细胞增至7.89μg/10~6个细胞,而正常黑色素细胞的锌含量仅从2.65μg/10~6个细胞波动到5.1μg/10~6个细胞,证明了HA/ZIF-8特异的肿瘤锌干扰能力。此外,经检测结果进一步发现,由于癌变早期大量锌离子外排,恶性黑色素瘤细胞的初始锌含量仅为正常黑色素细胞的1/3,其较低的初始锌含量增加了胞内锌波动的易感性。通过继续监测糖酵解途径相关产物含量发现,50μg/m L HA/ZIF-8特异地阻断了肿瘤细胞71.0%NAD+的生成,导致了64.6%GAPDH失活,最终减少了39.0%三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate,ATP）的生成。由于正常黑色素细胞锌稳态波动不显著,HA/ZIF-8阻断其胞内ATP生成的能力较弱（ATP仅减少8.9%）。同时,锌离子螯合剂TPEN有效地缓解了HA/ZIF-8介导的恶性黑色素瘤细胞NAD+的减少,GAPDH的失活,以及ATP的下降,证实了胞内锌过量是肿瘤糖酵解抑制的主要原因。上述结果说明HA/ZIF-8具有锌过量介导的肿瘤特异性能量耗竭能力。然而单一的糖酵解抑制通常会引发肿瘤细胞对葡萄糖需求的适应性上调,从而促进肿瘤细胞中葡萄糖转运蛋白1（Glucose transporter-1,GLUT1）的表达上调,增加葡萄糖摄取通量,导致能量封锁受限。为了实现肿瘤细胞较为彻底的能量耗竭,本课题设计了可特异性裂解GLUT1 m RNA的锌离子依赖型DNA酶（命名为GD）,并将其装载到HA/ZIF-8纳米粒内部,构建了一种兼具肿瘤靶向特性、双重刺激（低p H和透明质酸酶（Hyaluronidase,HAase））响应药物释放特性和锌离子启动基因沉默特性的锌离子过载型纳米药物（HA/ZIF-8@GD）。该纳米药物在锌过量介导的糖酵解抑制和GLUT1 m RNA降解的协同作用下,实现了“自上至下”的肿瘤能量封锁。制剂表征结果表明,HA/ZIF-8@GD形态均一,分散均匀,平均粒径约117.0 nm,平均Zeta电位约-19.7 m V。体外释药结果表明HA/ZIF-8@GD能够在透明质酸酶和低p H的双重刺激下,高效释放锌离子和GD。体外催化剪切结果表明,HA/ZIF-8@GD释放的锌离子足以启动GD介导的GLUT1 m RNA高效剪切。细胞摄取实验结果表明,HA/ZIF-8@GD经CD44受体介导的内吞作用主动靶向进入肿瘤细胞。靶向性入胞的HA/ZIF-8@GD介导的锌过量高效启动了GD的催化剪切活性,导致了50.1%GLUT1m RNA的降解、53.0%GLUT1蛋白下调和63%葡萄糖摄取受阻,证实了HA/ZIF-8@GD通过锌过量介导的自激活基因沉默疗法成功地阻断了肿瘤细胞对葡萄糖的摄取。最终,在锌过量介导的糖酵解抑制和葡萄糖摄取阻断的协同作用下,HA/ZIF-8@GD组的ATP含量相较于对照组和HA/ZIF-8组分别减少了60.7%和27.9%,显著地促进了恶性黑色素瘤细胞的凋亡,其凋亡率高达89.3%,证实了HA/ZIF-8@GD基于锌过量介导的“自上至下”能量耗竭策略具有优异的肿瘤抑制效果。体内实验进一步表明HA/ZIF-8@GD可特异性靶向肿瘤部位,高效抑制荷黑色素瘤小鼠肿瘤体积的增殖,肿瘤抑制率高达80.8%,且治疗后无明显毒副作用。总之,本课题为基于锌离子干扰疗法的抗肿瘤治疗提供了新策略。2.锌离子剥夺型佐剂样仿生纳米药物治疗NDM-1型耐药菌感染除恶性肿瘤外,细菌的抗生素耐药性（AMR）也是一个日益严重的全球公共卫生问题,特别是,产新德里金属-β-内酰胺酶-1（NDM-1）的肠杆菌科细菌,耐药谱广,感染病死率高,被WHO列为最需紧迫开发抗生素的重要病原之一。由于现有抗生素失效及新型抗生素研发困难,亟需新型临床治疗方法。通过抗生素-佐剂联合疗法逆转抗生素耐药被认为是最为经济有效且快速的治疗策略。然而,缺乏高效且安全的佐剂以及药物的脱靶毒性仍是联合疗法亟需解决的关键问题。前期研究表明,NDM-1是一类锌离子依赖型周质酶,寻找具有锌剥夺功能的生物活性纳米材料,并靶向递送至细菌周质间隙有望解决上述难题。基于此,通过“老材料-新应用”策略,本课题发现聚酰胺-胺型树枝状高分子（PAMAM）可作为锌离子高效配位络合剂,构建可剥夺NDM-1活性位点锌离子的递送系统,失活NDM-1,从而阻止NDM-1型大肠杆菌对典型的碳青霉烯类抗生素-美罗培南（Meropenem,MEM）的水解。此外,PAMAM还可在炎性介导的弱酸性微环境下,借助质子化效应诱导细菌外膜快速成孔,加速PAMAM的胞内转运,促进PAMAM对NDM-1的胞内靶向。美罗培南实时水解结果表明,在锌离子剥夺介导的NDM-1失活和质子化诱导的膜屏障打破的双重作用下,PAMAM阻止了NDM-1型大肠杆菌对美罗培南的水解（水解抑制率约为74.1%）。为了确保PAMAM联合美罗培南在体内的靶向性,减少其脱靶毒性,本课题将负载美罗培南的PAMAM（MEM@PAMAM）超声存储到血小板膜囊泡（Platelet membrane-derived nanovesicles,PMVs）内腔中,构建了一种具有强效锌离子剥夺、高效药物装载、病原体靶向和位点特异性药物突释等特性的锌离子剥夺型佐剂样仿生纳米药物（PMVs@MEM@PAMAM）。利用PMVs天然病原体亲和力和PAMAM的质子化效应,纳米囊泡能精确地将PAMAM和美罗培南递送到细菌感染部位,同时实现炎症弱酸微环境驱动的药物快速释放。制剂表征结果表明,PMVs@MEM@PAMAM具有均匀球形结构、单层膜涂层和高效药物装载能力,其美罗培南和PAMAM的平均装载率分别为36.8%和18.8%。体外靶向结果表明,得益于血小板膜表面的细菌粘附相关蛋白,PMVs能够靶向并粘附至细菌表面,从而增加美罗培南和PAMAM在细菌感染部位的积累。体外释药结果表明,PMVs@MEM@PAMAM能够响应细菌感染微环境的弱酸化,在PAMAM质子化效应的协助下快速且同步地释放PAMAM和美罗培南,在p H5.5的PBS介质下,4 h内PAMAM和美罗培南的释放总量约为81.1%和79.9%,证明了PMVs@MEM@PAMAM的位点特异性药物突释能力,为药物在细菌感染部位的高效发挥奠定了基础。体外抗菌实验结果表明,PMVs@MEM@PAMAM逆转了6株临床NDM-1型和6株临床NDM-5型大肠杆菌对美罗培南的耐药性。体内靶向实验证明,PMVs@MEM@PAMAM可特异性积累在细菌感染位点,并响应感染微环境释放药物。体内药物动力学研究表明,PMVs@MEM@PAMAM组的血液清除率（Clearance rate,CL）较美罗培南组下降近22倍,反映血小板膜仿生策略延长了美罗培南的血液循环时间。体内抗菌结果表明,PMVs@MEM@PAMAM有效减少了肺炎小鼠和脓毒症小鼠的感染组织细菌负荷量,将小鼠存活率提高至100%,且治疗后无明显毒副作用。总之,本课题通过锌离子负调控策略开发了一种纳米级锌离子剥夺型佐剂,为开发新型抗生素佐剂提供了一定的理论和实验基础。将聚合物-抗生素联用与仿生纳米技术相结合,为发展逆转细菌耐药新策略提供了新思路。