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研究背景:随着人口老龄化的发展,慢性疾病的发生率显著提高,其中糖尿病已成为威胁我国人民健康的最重要疾病之一。2010年杨文英和2013年宁光教授的研究均显示,我国已取代印度成为全球糖尿病患者人数最高的国家,而且糖尿病的发病率仍呈快速上升趋势,并向中青年,甚至儿童蔓延。不论1型或2型糖尿病,各种原因导致的胰岛β细胞数目减少和功能异常均是其发生和发展的重要原因。硫氧还蛋白相互作用蛋白(Trx interacting protein,TXNIP)在糖尿病的发病机制研究中的作用日益引起关注,它是目前已知唯一一个内源性硫氧还蛋白(Trx)结合及抑制蛋白,在糖尿病患者血清和组织中均呈现高表达。我们和他人课题组均研究证实了单纯过表达TXNIP可以通过内质网应激介导的途径、死亡受体途径和线粒体凋亡途径引起INS-1细胞凋亡增高。自噬是在大部分真核细胞中经常观察到的一种生命现象,可以清除降解细胞内受损的细胞器和不需要的生物大分子等以维持细胞内环境的稳态,减少细胞凋亡并起到保护细胞的作用,但也有研究表明,自噬水平的过度激活可促进凋亡的发生,而对器官组织造成额外的损伤。那么,TXNIP的升高对于自噬有何影响?其在TXNIP诱导的胰岛β细胞凋亡中又有何作用?本研究将对这两个问题进行探讨。目的:本实验旨在运用腺病毒转染技术建立TXNIP过表达INS-1胰岛细胞模型,观察正常培养条件下单纯过表达TXNIP的INS-1胰岛细胞自噬水平的变化,以及探讨自噬在TXNIP诱导的INS-1胰岛细胞凋亡中的作用。方法:1.使用腺病毒转染技术对INS-1胰岛细胞建立过表达TXNIP模型选用处于对数生长期的INS-1胰岛细胞,在25cm×25cm的培养瓶中培养,待细胞长满视野范围80%时细胞数量约为2×106个,弃掉培养基,PBS冲洗两次倒掉,随机分为3组,即正常培养组(Control),不含TXNIP的空载体腺病毒对照组(Ad-eGFP),含有TXNIP的过表达组(Ad-TXNIP-eGFP)。按感染复数MOI=50计算病毒量进行病毒转染,先将计算出的病毒体积加入1ml的1640中培养细胞,4h后补3ml含有10%胎牛血清和双抗的1640继续培养,于48小时转染效率最高时收集细胞。2.检测指标2.1应用实时定量PCR和Western blot方法检测INS-1胰岛细胞TXNIP m RNA的水平以及蛋白表达量。2.2用流式细胞术检测各组细胞凋亡情况。2.3应用Western blot方法测定各组细胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1、P62以及cleaved caspase 3/caspase 3的表达。2.4使用激光共聚焦显微镜观察自噬体的变化。结果:1.INS-1胰岛细胞过表达TXNIP成功与Control组相比,Ad-eGFP组TXNIP m RNA和蛋白水平未见明显差别,与Ad-eGFP组相比,Ad-TXNIP-eGFP组TXNIP m RNA(图1)和蛋白水平明显增高(图2),说明病毒构建成功、病毒转染目的蛋白造模成功。2.过表达TXNIP引起INS-1胰岛细胞凋亡增加。使用Annexin V-APC/7-AAD染色经流式细胞术检测凋亡表明Ad-TXNIP-eGFP组细胞凋亡率增多:与Ad-eGFP组相比,Ad-TXNIP-eGFP组细胞凋亡率增多,而Ad-eGFP组与Control组无明显差异(图4)。Ad-TXNIP-eGFP组cleaved caspase 3/caspase 3比值增高:cleaved caspase 3的生成是凋亡的共同通路,与Control组相比,Ad-eGFP组cleaved caspase 3/caspase 3比值未见统计学差异;与Ad-eGFP组相比,Ad-TXNIP-eGFP组显著增高(图3),进一步证实了TXNIP的上调可引起INS-1胰岛细胞的凋亡增加。3.TXNIP表达上调可引起INS-1胰岛细胞自噬水平的升高。与Control组相比,Ad-eGFP组的自噬标志物LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白水平、Beclin-1蛋白水平未见明显差别,与Ad-eGFP相比,Ad-TXNIP-eGFP组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白水平是升高的(图5),Beclin-1蛋白水平也增多(图6),二者增多说明自噬反应生成增多。由于P62是自噬降解的底物,随自噬的加强,其水平逐渐降低,是自噬检测的常用标志物,与Control组相比,Ad-eGFP组P62蛋白水平未见统计学差异,与Ad-eGFP组相比,Ad-TXNIP-eGFP组P62蛋白水平降低(图7),表明自噬溶酶体降解增多,自噬反应增多。4.激光共聚焦显微镜下观察到Ad-TXNIP-eGFP组自噬体增多使用LC3B多克隆抗体对自噬细胞进行染色,共聚焦显微镜下摄片并分析:Control组和Ad-eGFP组之间染色所呈的红色荧光无显著差别,均很弱;与Control组和Ad-eGFP组相比,Ad-TXNIP-eGFP组自噬荧光显著增强,细胞内出现了明显的红色荧光,表明过表达TXNIP促进自噬体生成(图8)。5.3-MA(5m M)抑制自噬后TXNIP上调引起的INS-1胰岛细胞凋亡减少。5.1 3-MA(5m M)抑制了TXNIP上调引起的INS-1胰岛细胞自噬水平的升高。为了证实自噬的改变在TXNIP上调引起的INS-1胰岛细胞凋亡中的作用,采用了自噬抑制剂3-methyladenine(3-MA)进行干预,将细胞进一步分组为:Control组、Ad-eGFP组、Ad-TXNIP-eGFP组、Control+3-MA组、Ad-eGFP+3-MA组、Ad-TXNIP-eGFP+3-MA组,对前述几个自噬标志物的检测结果显示:Control+3-MA与Control组相比无统计学差异;Ad-eGFP+3-MA组与Ad-eGFP组相比也无统计学差异;与Ad-TXNIP-eGFP组相比,Ad-TXNIP-eGFP+3-MA组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明显降低(图9),Beclin-1表达明显降低(图10),而P62表达明显增多(图11),以上结果说明,3-MA抑制了TXNIP过表达诱导的自噬发生。5.2自噬抑制后TXNIP上调引起的INS-1胰岛细胞凋亡减少。使用Annexin V-APC/7-AAD染色,流式细胞术检测凋亡的结果显示:Control+3MA组与Control组相比无统计学差异;Ad-eGFP+3-MA组与Ad-eGFP组相比无统计学差异;Ad-TXNIP-eGFP+3-MA组与Ad-TXNIP-eGFP组相比INS-1细胞凋亡减轻(图13)。使用Western blot对cleaved caspase 3/caspase 3的检测也取得类似结果,Ad-TXNIP-eGFP+3MA组cleaved caspase 3/caspase 3比值明显降低(图12),同样表明使用自噬抑制剂后,TXNIP诱导的细胞凋亡减轻。结论:1.在INS-1细胞单纯过表达TXNIP可以诱导自噬增加;2.TXNIP诱导INS-1细胞自噬可以增加细胞凋亡的发生。