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目的:颞叶癫痫是最常见的癫痫类型,且绝大多数是药物难治性癫痫,其发病机制尚不十分清楚。脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)促进了神经元的存活、生长发育及分化等过程。其生物学功能主要通过特异性受体酪氨酸激酶B(tyrosine kinase receptor B,Trk B)介导而实现。近来研究表明BDNF-Trk B信号通路在癫痫的发生与发展过程中起着关键作用。微小RNA(micro RNA)是一种内源性非编码蛋白的小分子RNA。现已被证实其在多种神经系统疾病中发挥着重要功能。研究发现mi R-132在癫痫发病过程中发挥了重要作用,但具体机制有待研究。本课题旨在通过检测转染mi R-132后的海马神经元癫痫模型中Trk B蛋白磷酸化水平的变化,来了解其对BDNF-Trk B信号通路的调控作用,并探讨其在癫痫发病中的作用。方法:制备mi R-132慢病毒表达载体。采用24小时内新生Sprague Dawley(SD)大鼠,取海马神经元体外原代培养7天。采用完全随机化方法将细胞分为①正常组、②癫痫组、③正常+BDNF组、④癫痫+BDNF组、⑤正常+mi R-132组、⑥癫痫+mi R-132组、⑦正常+BDNF+mi R-132组、⑧癫痫+BDNF+mi R-132组。利用膜片钳技术检测海马神经元放电情况,荧光定量PCR法检测海马神经元中mi R-132的表达情况,利用免疫印迹技术检测海马神经元中Trk B和p-Trk B蛋白的表达情况,Quantity one软件对Trk B及p-Trk B的灰度值进行分析,p-Trk B与Trk B的比值表示BDNF-Trk B通路的激活状态。方差分析进行统计学分析,检验水准a=0.05,数据使用SPSS19.0统计软件包进行分析,p≤0.05为有统计学意义。癫痫模型的制备方法是:细胞培养至第7d时,用“无镁”细胞外液处理3h,建立大鼠海马神经元癫痫模型。转染mi R-132组的处理方法是:培养至第7d时加入mi R-132慢病毒稀释液,24h后换成完全培养液继续培养24小时。加入BDNF组的处理方法是:于提取蛋白前10min在培养液中加入BDNF。结果:1、膜片钳技术检测海马神经元痫样放电:与正常组相比,体外培养7d后的癫痫模型组大鼠海马神经元自发性放电频率明显增加(p=0.001)。2、荧光定量PCR法检测mi R-132表达示:与正常组相比,癫痫组mi R-132表达明显增加,差异有统计学意义(p<0.001)。3、蛋白免疫印迹结果显示:⑴与癫痫组相比,正常组p-Trk B/Trk B值较高,差异有统计学意义(p=0.008);⑵与正常组和相比,正常+BDNF组p-Trk B/Trk B值升高,差异有统计学意义(p=0.015);⑶与癫痫组相比,癫痫+BDNF组p-Trk B/Trk B值升高,差异有统计学意义(p=0.012);⑷与癫痫+mi R-132组相比,癫痫组p-Trk B/Trk B值较高(p=0.004),癫痫+BDNF+mi R-132组p-Trk B/Trk B值较高(p=0.030)。4、结果提示:加入外源性BDNF后,正常组和癫痫组的p-Trk B/Trk B值均明显升高。说明外源性BDNF可以激活BDNF/Trk B通路,而加入mi R-132后,癫痫组和癫痫+BDNF组的p-Trk B/Trk B值均有所降低结论:1.癫痫状态下,海马神经元mi R-132表达增高。2.加入外源性BDNF后,正常组和癫痫组的p-Trk B/Trk B值均明显升高。说明外源性BDNF可以激活BDNF/Trk B通路。3.正常组比癫痫组的p-Trk B/Trk B值高,说明BDNF-TrkB信号通路在癫痫状态下处于受抑制状态。4.癫痫神经元转染mi R-132后,p-Trk B/Trk B值均有所下降,说明海马神经元转染mi R-132后,抑制了BDNF-Trk B信号通路。