论文部分内容阅读
研究背景及目的:脓毒症(sepsis)是一种临床上常见的危重病症,因脓毒症而引起的多脏器功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)是导致ICU病人死亡的主要原因之一。作为革兰氏阴性菌细胞外膜主要成分之一的脂多糖(lipopolysaccharide, LPS),也称内毒素(endotoxin),是脓毒症发生的主要致病因子,因此,从源头上阻止脓毒症的发生即封闭LPS触发的炎症瀑布反应是对抗脓毒症的有效手段之一。鲎抗内毒素因子(limulus anti-lipopolysaccharide factor, LALF)是来自于海洋生物鲎血液变形细胞中的一种蛋白,对LPS介导脓毒症的活性具有显著的抑制作用。我们在前期工作中,通过对LALF功能区结构特点的分析,以LALF为模板并采用计算机模拟设计了一条多肽,应用固相合成并且经过末端酰胺化和首尾环化得到了一条具有19个氨基酸残基的环状鲎抗内毒素因子模拟肽,并将其编号为CLP-19。经过初期的活性考察发现,CLP-19能与LPS结合并且在体外具有LPS中和活性。因此在本研究中,我们将对CLP-19抗脓毒症的活性进行考察,在此基础上对CLP-19抗LPS介导的脓毒症的作用机制进行初步探讨。实验方法:第一部分:模拟肽CLP-19抗脓毒症活性研究1. CLP-19对D-氨基半乳糖致敏的内毒素休克小鼠的保护作用:观察三个剂量的CLP-19 (0.5,1.0和2.0mg/kg)与LPS (50μg/kg)同时给药以及单一剂量的CLP-19 (2.0mg/kg)分别在LPS前1h、后1h以及同时给药时小鼠的生存率;组织病理学检查CLP-19 (2.0mg/kg)对LPS休克小鼠肺、心、肝、肾和小肠的保护作用;ELISA法测定CLP-19 (2.0mg/kg)与LPS同时给药后模型小鼠的血清TNF-α水平。2. CLP-19对大肠埃希氏菌急性腹膜炎小鼠的保护作用:观察CLP-19 (2.0mg/kg)不同时间预防性给药(提前5、10和20h)后大肠埃希氏菌急性腹膜炎小鼠的生存情况;考察CLP-19 (2.0mg/kg)提前20h给药后对感染小鼠血清TNF-α水平的影响;考察CLP-19 (2.0mg/kg)不同时间预防性给药(提前5、10和20h)对感染小鼠体内细菌量的影响。第二部分:模拟肽CLP-19抗脓毒症机制研究1. CLP-19对LPS与LBP结合的影响:将LPS包被于96孔板,以竞争性ELISA法测定LPS-LBP的结合,当CLP-19 (10~100μg/ml)与LBP (100ng/ml)同时加入时,考察CLP-19影响LPS与LBP结合的剂量效应;不同时间加入CLP-19 (20, 40和80μg/ml)后,考察其影响LPS与LBP结合的时间效应。2. CLP-19对LPS刺激的人外周血单核细胞TNF-α释放的影响:考察CLP-19 (10~100μg/ml)与LPS (100ng/ml)预先混合后抑制PBMC释放TNF-α的剂量效应;考察CLP-19 (100μg/ml)在不同时间加入对LPS刺激的PBMC释放TNF-α的影响。3. CLP-19对IL-1β刺激的小鼠RAW264.7细胞TNF-α释放的影响:考察不同浓度的CLP-19 (1,10和100μg/ml)分别在IL-1β(100ng/ml)加入前、后和同时加入对RAW264.7细胞TNF-α释放的影响。4. CLP-19对LPS与小鼠RAW264.7细胞结合的影响:在无血清条件下,将罗丹明标记的CLP-19 (5μg/ml)和FITC-LPS (10μg/ml)先后与细胞孵育,用激光共聚焦显微镜观察LPS与细胞的结合情况。5. CLP-19对LPS刺激的小鼠RAW264.7细胞NF-κB激活的影响:CLP-19 (1, 10和100μM)预先与细胞共孵,加入LPS (1μg/ml)刺激后提取细胞核蛋白,采用NF-κB p65 ELISA试剂盒测定NF-κB的活化情况。实验结果:第一部分:模拟肽CLP-19抗脓毒症活性研究1.三个剂量的CLP-19 (0.5,1.0和2.0mg/kg)与LPS同时给药时小鼠的生存率分别为20%, 50%和90%;单一剂量的CLP-19 (2.0mg/kg)分别在LPS前1h、后1h以及同时给药时小鼠的生存率分别为20%, 60%和90%;CLP-19 (2.0mg/kg)与LPS (50μg/kg)同时给药的小鼠肺、肝、心、肾和小肠病变程度明显减轻,小鼠血清TNF-α水平显著降低。2. CLP-19 (2.0mg/kg)在感染前20h给药对感染小鼠具有中度保护作用,其保护率为40%并且将小鼠血清TNF-α水平提前降至正常水平;在实验考察的5～20h内, CLP-19与菌液的注射时间间隔越长,小鼠生存率越高,动物体内的细菌量越低;第二部分:模拟肽CLP-19抗脓毒症机制研究1. CLP-19与LBP (100ng/ml)同时加入和先于LBP 30min加入,均在10μg/ml～40μg/ml浓度范围内对LPS与LBP结合的抑制具有剂量效应,且活性相当;CLP-19在LBP之后加入,随着延后的时间越长,抑制活性显著降低。2. CLP-19与LPS (100ng/ml)预先混合后再加入时,在10μg/ml～40μg/ml的浓度范围内对细胞释放TNF-α的抑制具有剂量效应;不同时间加入CLP-19对细胞释放TNF-α的抑制作用的大小顺序为:CLP-19与LPS预先混合后再加入> CLP-19先于LPS加入> CLP-19后于LPS加入。3. CLP-19(1,10和100μg/ml)抑制IL-1β(100ng/ml)刺激的小鼠RAW264.7细胞释放TNF-α具有明显的剂量效应。4. CLP-19自身能与巨噬细胞结合,在无血清环境下能协助LPS与细胞结合。5. CLP-19能单独导致NF-κB的激活,在低、中浓度CLP-19 (1μM和10μM)处理细胞后再经LPS刺激表现出对NF-κB的激活,但高浓度CLP-19 (100μM)则明显抑制NF-κB的激活。结论:1.鲎抗内毒素因子模拟肽CLP-19具有显著的抗脓毒症活性,对LPS休克小鼠和E.coli急性腹膜炎小鼠具有保护作用。2. CLP-19抑制LPS介导的脓毒症炎症瀑布反应的作用可能存在如下机制: (1) CLP-19对LPS与LBP结合的抑制; (2) CLP-19对LPS与靶细胞结合的灭活载体效应; (3) CLP-19对LPS介导的小鼠巨噬细胞NF-κB活化的双向调节作用以及对宿主免疫系统的调节作用。