两种甾体皂苷的微生物转化研究

来源 :北京协和医学院 | 被引量 : 0次 | 上传用户:Thomas1007
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甾体皂苷是一类重要的天然活性产物,常见中药如知母、麦门冬、穿山龙以及七叶一枝花等都含有大量甾体皂苷。其具有多种药理活性如抗肿瘤、抗血小板凝集、调节免疫、抗炎以及心脑血管活性等。为了了解药物的构效关系寻找高效低毒的目标产物,研究人员一直在寻找有效的方法改造甾体皂苷。近年来,利用生物转化改造甾体皂苷研究受到广泛关注,与传统化学法相比其具有条件温和、环境友好、区域和立体选择性高等优势。为了获得活性好毒性低的目标产物,本论文研究了两种甾体皂苷-原薯蓣皂苷(Protodioscin)和伪原薯蓣皂苷(Pseudoprotodioscin,PPD)的生物转化,并对转化产物的药理活性进行了初步探索。筛选25株菌种对原薯蓣皂苷和伪原薯蓣皂苷的转化,通过TLC验证,筛选出转化率较高且转化产物较多的菌株,并对转化天数的考察,确定最佳转化时间。最终选取真菌橄榄色毛壳Chaetomium olivaceum CGMCC 3.3604和灰葡萄孢Botrytis cinereaa CGMCC3.3789对原薯蓣皂苷进行转化以及菌株藤仓赤霉Gibberella fujikuroi 3.4663对伪原薯蓣皂苷进行扩大培养。发酵液经过溶剂萃取,硅胶柱色谱,Sephadex LH-20凝胶柱色谱以及半制备液相等分离手段分离,得到转化产物。从Chaetomium olivaceum CGMCC 3.3604对原薯蓣皂苷进行生物转化研究中,得到4个已知转化产物26-O-β-D-glucopyranosyl-22α-methoxy-(20S,25R)-furost-5-ene-3β,26-diol-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-ββ-D-glucopyranoside(1),26-O-β-D-glucopyranosyl-(20S,25 R)-furost-5-ene-3β,22α,26-triol-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranoside(2),薯蓣次级皂苷B(3)和薯蓣皂苷(4)。从灰葡萄孢Botrytis cinerea转化原薯蓣皂苷的发酵液中分离出1个糖水解产物薯蓣次级皂B(3)。菌株藤仓赤霉Gibberella fujikuroi对伪原薯蓣皂苷转化,共得到12个转化产物。分别为26-O-β-D-glucopyranosyl-22α-methoxy-(20S,25R)-furost-5-ene-3β,26-diol-3-O-α-L-rhamnopyran osyl-(1→4)-β-D-glucopyranoside(1).26-O-β-D-glucopyranosyl-(20S,25R)-furost-5-ene-3ββ,22α,26-triol-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranoside(2),薯蓣次级皂苷 B(3),26-O-β-D-glucopyranosyl-20α-methoxyl-25R-furosta-5,22-diene-3β,26-diol-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1 →4)-β-D-glu-copyranoside(5),26-0-β-D-glucopyranosyl-22β-methoxy-25R-furosta-5-ene-3β,20β,26-triol-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranoside(6),26-O-β-D-glucopyranosyl-25R-furosta-5,22-diene-3β,20β,26-triol-3-O-α-L-26-rhamnopyranosyl-(1 →4)-β-D-glucopyranoside(7),16β-(4’R-methyl-5’-ol-pentanoxyl)-pregn-5-ene-3β-ol-20-one-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-ββ-D-glucopyra Noside(8),pregnan-5.16-diene-20-one-3β-hydroxy-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranoside(9),25R-spirost-5-ene-3β,20-diol-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1 →4)-β-D-glucopyranoside(10),25R-spirost-5,20-diene-3β-ol-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-/β-D-glucopyranoside(11),25R-spirost-5-ene-21 β-methyl-3β-ol-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranoside(12),25S-spirost-5-ene-3β,20α-diol-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranoside(13),其中化合物 8,11,13为新化合物。微生物对两种甾体皂苷的转化位点主要集中在苷元的C20(22)位以及C-3位和C-26位糖链上。所得到的转化产物皆为糖水解产物,化合物8和9为孕甾烷结构骨架。转化反应涉及多种类型包括糖水解反应、羟基化反应、甲基化反应、氧化还原反应等,通过对转化产物的结构进行分析并根据参考文献报道分别对两种底物微生物转化的可能途径进行了推测。对转化产物进行药理活性初步研究,化合物3,4,5,8,11,13对HepG2细胞有一定毒性,化合物3,4,10,11,13对Hela细胞有毒性作用。化合物7和9具有一定抑制LPS刺激的RAW264.7细胞炎症因子表达的作用。进一步的研究表明其对NO分泌的抑制作用,可能是通过抑制RAW264.7细胞中iNOS蛋白表达实现的。
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