继发性神经元损伤是决定创伤性脑损伤(traumatic brain injury，TBI)患者预后的关键因素，其机制是一种复杂的级联反应，包括兴奋性氨基酸毒性、氧化损伤、炎症反应、钙离子超载和凋亡通路激活等等。之前的药物治疗研究，主要是针对其中某一种损伤机制进行阻断，但是到目前为止，尚无一种药物被证实具有显著的临床疗效。体外试验发现，在上述引起继发性神经元损伤的多种毒性攻击情况下，NF-E2相关因子2(the nuclear factor E2-related factor2，Nrf2)-抗氧化反应元件(theantioxidant response element，ARE)通路都被激活，且上调该通路在多种细胞和组织中都能够表现出保护作用。最新的研究证实Nrf2-ARE通路亦具有神经保护作用。因此，我们推断激活Nrf2-ARE通路可能在TBI的治疗中发挥“一个靶点，多重保护”的作用，为TBI的药物研究提供一种新的思路。本课题旨在研究Nrf2-ARE通路在TBI中的作用与机制。　　 第一部分绪论　　 本节旨在介绍相关研究背景，对以下内容进行综述：1.TBI后继发性神经元损伤机制；2.TBI的药物治疗研究进展；3.Nrf2-ARE通路研究进展。　　 第二部分创伤性脑损伤后Nrf2在大鼠脑组织中的表达继发性神经元损伤机制非常复杂，因此寻找一个能够同时干预多种继发性损伤机制的靶点，可能成为TBI药物治疗的新思路。Nrf2是体内抑制氧化损伤、调节炎症反应以及代谢有害物质的关键分子，对继发性损伤的多种机制都有调节作用，因此Nrf2可能成为TBI治疗的新靶点。但是，TBI后脑组织内Nrf2的表达情况尚未被研究。本部分通过使用RT-PCR及Western blot的方法，分别检测了TBI后3 hr，6 hr，12 hr，24 hr和72 hr损伤灶周围皮层Nrf2 RNA及核内蛋白表达水平的改变。同时，使用免疫组化技术检测Nrf2在脑组织内的分布情况。研究发现，TBI后损伤灶周围皮层细胞核内Nrf2蛋白含量显著上升，而Nrf2 RNA表达水平没有明显改变。Nrf2主要分布在易损伤部位以及血脑屏障。因此，Nrf2在TBI后表达增加，可能对脑组织起到保护作用。　　 第三部分创伤性脑损伤后Nrf2-ARE通路在脑组织中的激活Nrf2-ARE通路调节一系列细胞保护性蛋白的表达，而TBI后脑组织内该通路是否被激活尚未得到研究。本节中，通过使用RT-PCR方法检测该通路下游分子HO-1、NQO1 RNA含量，并使用免疫组化对HO-1和Nrf2的表达定位。同时检测了谷氨酸/胱氨酸逆向转运体的功能单位xCT在TBI后3 hr，6 hr，12 hr，24hr，72hr的RNA及蛋白含量。研究发现，TBI后皮层内HO-1及NQO1的RNA含量显著提高；免疫组化提示Nrf2与HO-1细胞分布类型一致。xCT RNA及蛋白含量与细胞核内Nrf2蛋白含量具有显著相关性。综上所述，TBI后脑组织内Nrf2-ARE通路被激活。　　 第四部分创伤性脑损伤后Nrf2-ARE通路的脑保护作用氧化损伤、钙离子超载、炎症反应以及细胞凋亡等多种机制参与TBI后继发性神经元损伤。Nrf2-ARE通路是其中多种机制的关键调节因素。本部分在实验性TBI模型中评估Nrf2-ARE通路激动剂莱菔硫烷(sulforaphane，SUL)对TBI的治疗作用。54只SD大鼠随机分为3组：对照组，TBI+vehicle组及TBI+SUL组(每组18只)。使用比色法检测损伤灶周围皮层谷胱甘肽(glutathione，GSH)含量，使用干湿重比法检测脑水肿情况，使用TUNEL法评估神经细胞凋亡情况。研究发现，外伤后皮层GSH含量显著降低，而注射SUL可以减轻GSH的消耗。外伤侧大脑半球水含量明显升高，SUL可以减轻脑水肿。而损伤对侧脑组织水含量变化不明显。TUNEL阳性细胞数在TBI+vehicle组升高，但在给予SUL后较单纯外伤组减少。上述结果表明，激活Nrf2-ARE通路对TBI具有治疗作用。　　 第五部分创伤性脑损伤后Nrf2-ARE通路在肺组织中的激活急性肺损伤是TBI的常见并发症，但是目前对其认识尚不充分。TBI后肺组织发生广泛的氧化损伤和炎症反应，而Nrf2-ARE通路是体内抑制氧化损伤和调节炎症反应的关键机制。因此我们推断，TBI后肺组织内Nrf2-ARE通路作为一种内源性保护机制反应性激活。通过使用Western blot和RT-PCR的方法，分别检测了TBI后24 hr肺组织细胞核内Nrf2蛋白含量及其下游分子HO-1、NQO1 RNA含量；同时使用免疫组化对Nrf2和HO-1的分布进行定位。研究发现，TBI后肺组织Nrf2蛋白向细胞核内转移，HO-1、NQO1 RNA表达显著上升；Nrf2和HO-1皆定位于支气管上皮细胞和肺泡巨噬细胞。上述结果表明，TBI后肺组织内Nrf2-ARE通路被激活。　　 第六部分创伤性脑损伤后Nrf2-ARE通路在肠组织中的激活肠功能障碍是TBI的常见并发症，并对患者预后有重要影响。本实验室前期研究发现炎症损伤在TBI后肠功能障碍中起重要作用，而TBI后肠组织内源性保护机制是否被启动尚未得到研究。研究证实，Nrf2-ARE通路在多种肠道炎症疾病中起保护性作用，因此我们推断TBI后肠组织内Nrf2-ARE通路亦被激活。通过对TBI后24 hr肠组织细胞核内Nrf2蛋白含量及HO-1、NQO1 RNA含量的检测，并对Nrf2和HO-1的分布进行定位发现，TBI后肠组织Nrf2蛋白向细胞核内转移，HO-1、NQO1 RNA表达显著上升；Nrf2和HO-1皆定位于肠上皮细胞和粘膜固有层细胞。上述结果表明，TBI后肠组织内Nrf2-ARE通路被激活。