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VP3是由鸡贫血病毒（chicken anemia virus，CAV）编码产生的一种由121个氨基酸组成的小分子蛋白。Noteborn等因其能特异性诱导人肿瘤细胞凋亡，因此将这种小分子病毒蛋白命名为凋亡素（Apoptin）。对不同来源的肿瘤细胞和正常细胞的研究发现，VP3/Apoptin仅诱导具有肿瘤表型的细胞或转化细胞凋亡，而对人正常细胞无杀伤性或无毒性，是一种特异性诱导人肿瘤细胞凋亡的蛋白。对VP3/Apoptin蛋白质序列分析发现，VP3/Apoptin含有两个细胞核定位信号（nuclear localization signal，NLS）区域，分别位于82-88和111-121氨基酸。故VP3/Apoptin的肿瘤细胞特异性凋亡效应与VP3/Apoptin的细胞核定位效应密切相关。生物物理学研究发现VP3/Apoptin与DNA具有高亲和性。重组MBP-Apoptin在体外能与裸DNA片段（约3kb）高亲和力结合，形成直径为200nm的包含20个MBP-Apoptin多聚体结构。提示VP3/Apoptin可能是通过定向迁移至细胞核内，与DNA结合并干扰DNA转录，从而诱导肿瘤细胞凋亡。为了观察VP3/Apoptin在肿瘤细胞中的分布、亚细胞定位及其与VP3/Apoptin凋亡效应的关系，利用增强型绿色荧光蛋白（EGFP）为示踪物，构建了N-端带有EGFP的EGFP-Apoptin融合蛋白真核表达载体pEGFP-Apoptin。EGFP和VP3/Apoptin以融合蛋白形式进行表达。并且将EGFP连接在VP3/Apoptin的N端，以尽可能减少EGFP对VP3/Apoptin核定位效应和凋亡效应的影响。将质粒pEGFP-Apoptin转染人肝癌细胞株HepG2，24h后观察EGFP-Apoptin融合蛋白在细胞中得以高效表达，EGFP-Apoptin融合蛋白逐渐从细胞质向细胞核迁移，并定位于细胞核，48h左右可见EGFP-Apoptin融合蛋白富集于细胞核内，细胞核呈强绿色荧光，细胞核轮廓清晰，而细胞质无荧光；多数转染细胞核内荧光分布不均匀，EGFP-Apoptin在细胞核内呈区域性聚集趋势，点状或灶状分布；部分转染细胞胞浆收缩，胞核皱缩，细胞发生凋亡。而转染质粒pEGFP的对照组，EGFP在细胞中分布均匀，细胞核和细胞质内均有绿色荧光，并且无明显差别。进一步将质粒pEGFP-Apoptin转染HepG2细胞4-5D后，TUNEL法原位检测细胞凋亡，可见部分肿瘤细胞凋亡；而转染pEGFP的对照组未检测到凋亡细胞。表明N-端带有EGFP标记的EGFP-Apoptin融合蛋白能诱导肿瘤细胞凋亡。尽管VP3/Apoptin诱导肿瘤细胞凋亡的机制尚有待进一步阐明，但大量实验研究证实vp3基因转染或直接将VP3/Apoptin蛋白导入肿瘤细胞的结果表明其均可诱导细胞凋亡效应。探讨如何利用VP3/Apoptin蛋白在活体内安全有效地诱导肿瘤细胞特异性凋亡无疑具有十分重要的临床应用意义。蛋白质转导技术（protein transduction technology）是近年来新兴的一种大分子转移策略：利用一些具有蛋白质转导结构域（protein transduction domain，PTD）的蛋白质或多肽，直接将具有治疗作用的生物大分子“送”入细胞发挥效应。这种具有穿过细胞膜的能力的多肽称为细胞透膜肽（Cell-Penetrating Peptides，CPPs），如TAT（trans-activator of transcription）（11肽、13肽）、Antp（16肽）、VP22（34肽）、Transportan（28肽）、MAP（18肽）。CPP可传送的物质范围很广泛，如蛋白质、DNA、抗体、显像试剂、毒素、纳米药物颗粒、脂质体等。TAT跨膜转导序列来源于HIV中TAT蛋白，它可介导与其结合的蛋白透过细胞膜，发挥相应蛋白质的生物学功能。因此，构建TAT与VP3/Apoptin的融合蛋白，利用TAT的跨膜转导作用对粘膜、表皮和皮下肿瘤进行透膜治疗，有可能成为VP3/Apoptin治疗肿瘤的一种新的有效手段。本研究在建立裸鼠肝癌移植瘤模型中，利用TAT-VP3融合蛋白瘤体表面涂抹的方法，观察其透皮治疗裸鼠肝癌移植瘤的抑瘤治疗效应，为临床应用提供实验依据。我们利用制备的TAT-VP3融合蛋白，利用TAT直接将VP3/Apoptin蛋白导入细胞，继而利用VP3/Apoptin特异性地诱导肿瘤细胞凋亡的特性，从而实现促进肿瘤凋亡、抑制肿瘤生长。在移植瘤动物模型中观察到了TAT-VP3融合蛋白诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤生长的效应。考虑到输入外源性蛋白的安全性以及给药途径和剂量控制等因素，我们采取的给药途径是皮肤涂抹。当人肝癌皮下荷瘤裸鼠模型的瘤块生长7天后，随机分成实验组和空白对照组，其P值为0.05445（P＞0.05）无明显差异。实验中第3天、7天分别测量实验组和空白对照组裸鼠的瘤块体积来了解抑制肿瘤生长的情况，两组间瘤块体积经统计学分析，P值分别为0.011272（P＜0.05）、0.002143（P＜0.01），具有显著性差异，表明TAT-VP3融合蛋白具有抑制荷瘤裸鼠皮下的人源性肝癌细胞HepG2的生长。因VP3/Apoptin蛋白易被蛋白酶水解，且本实验是在瘤体直径已达8mm左右时才给予治疗，给药时间亦只有一周。所以在以后的研究中可考虑早期用药、增加每天给药次数、延长用药时间等，以进一步增强其抑瘤效应。VP3/Apoptin腺病毒载体活体治疗的研究实验表明VP3/Apoptin可达动物全身各脏器组织，但未发现其对正常组织细胞诱导产生凋亡效应。本研究经皮肤涂抹给药，故其安全性更为可靠。本研究表明：EGFP-Apoptin融合蛋白在人肿瘤细胞中具有定向迁移至细胞核的核定位效应，并且能诱导肿瘤细胞凋亡，这一新的融合标志蛋白的实验结果进一步验证了Noteborn等的观点，因此pEGFP-Apoptin可以作为研究VP3/Apoptin在肿瘤细胞中分布和亚细胞定位的有效工具，用以进一步探讨其诱导肿瘤细胞凋亡的机制。另一方面，我们探讨了具有透膜作用的VP3/Apoptin融合蛋白对荷瘤裸鼠的抑瘤效应。利用制备的TAT-VP3融合蛋白，在建立人肝癌裸鼠荷瘤模型中，通过TAT-VP3瘤体表面涂抹治疗方法，观察瘤体生长抑制效应。实验组瘤体生长受到明显抑制，瘤重抑制率为56.9％。这些结果证实TAT-VP3融合蛋白具有很好的透皮效果，能显著抑制瘤体的生长。随着细胞生物学和分子生物学等研究的发展，蛋白或肽类大分子物质将越来越广泛地应用于临床多种疾病的治疗。利用TAT-VP3融合蛋白表面涂抹的治疗给药途径，一方面可利用TAT透膜肽提高目的蛋白穿透生物膜的效应；另一方面，VP3/Apoptin的特异诱导凋亡作用可规避其它治疗方法难以避免的毒副作用影响，这就为临床应用生物大分子治疗肿瘤开辟了广阔的前景。在现有的国内外研究中，利用TAT-VP3透膜治疗肿瘤尚未见报道。故本研究极可能为VP3/Apoptin的临床应用开辟一条全新的治疗途径。