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第一章高胰岛素血症对冠心病患者血浆非对称性二甲基精氨酸水平的影响目的：2型糖尿病(T2DM)疾病早期或使用胰岛素治疗期间均有高胰岛素血症,高胰岛素血症促进动脉粥样硬化,是冠心病的独立危险因素。血管内皮功能障碍是动脉粥样硬化的始动环节,内皮来源的NO减少是其损伤的特征性表现,非对称性二甲基精氨酸(ADMA)是内源性NOS抑制剂,减少NO合成,为心血管死亡预测因子。本章研究拟探讨高胰岛素血症对人体血浆ADMA的影响,为高胰岛素血症损伤内皮提供依据。方法：来自2009年9月～2010年5月中南大学湘雅医院心内科冠心病患者及体检中心健康人群,共89人,分为三组：(1)正常对照组(Con)：30例；(2)冠心病组(CAD)：30例；(3)冠心病合并高胰岛血症组(CAD+Hins):29例。测身高、体重,计算体重指数(BMI)；测腰围、臀围,计算腰/臀(WHR)测血压。采集过夜空腹10h静脉血5mL,全自动生化分析仪测定：肝功能、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、空腹血糖(FPG)、高敏C反应蛋白(hs-CRP)、尿酸(UA)、尿素氮(BUN)、血肌酐(Cr); AXSYM全自动标记免疫化学发光仪检测空腹胰岛素(Fins)、餐后2h胰岛素(2h-PIns)。结果：1. CAD+Hins组、CAD组、Con组三组间性别、年龄、血压、肝功能无显著性差异,存在可比性。2. CAD+Hins组BMI, FPG, Fins,2h-Pins, HOMA-IR均显著高于CAD组和Con组(P<0.05),CAD组上述指标显著高于Con组(P<0.05)。3.各组间TC无统计学差异,CAD+Hins组和CAD组的TG、HDL-C以及UA. Cr, BUN均显著高于Con组(P<0.05);CAD组LDL-C显著高于Con组(P<0.05); CAD+Hins组UA显著高于CAD组(P<0.05)。4. CAD+Hins组ADMA, hs-CRP水平显著高于CAD组和Con组(P<0.05)；CAD组ADMA显著高于Con组(P<0.05)。5.未发现血浆ADMA与其他生化指标的相关性。结论：1.高胰岛素血症加重已患冠心病患者的糖、脂代谢与尿酸代谢障碍。2.高胰岛素血症引起冠心病患者血浆ADMA水平进一步升高,是内皮功能损伤加重的表现；3.合并高胰岛素血症的冠心病患者血浆hs-CRP水平升高,提示高胰岛素血症与慢性炎症有关。第二章高胰岛素血症大鼠血浆ADMA/NO和主动脉SREBP、DDAH变化及与内膜损伤关系目的：第一章临床研究发现合并高胰岛素血症的冠心病患者血浆ADMA水平显著高于单纯冠心病患者与健康对照,提示高浓度胰岛素对内皮的损伤作用。二甲基精氨酸二甲胺水解酶(DDAH)是水解ADMA的关键酶,调节体内ADMA浓度。DDAH启动子区含有能与固醇调节元件结合蛋白(SREBPs)相结合的胆固醇调节组件(SRE),提示SREBPs可结合SRE调节DDAH的表达；研究表明：高胰岛素有促进SREBPs表达的作用。探讨高胰岛素血症SD大鼠主动脉SREBPs、DDAH的表达有助于进一步阐述高胰岛素损伤内皮的具体机制。本章研究拟建立高胰岛素血症SD大鼠动物模型,直接阐述高胰岛素对主动脉内膜损伤作用并探讨其可能机制。方法：采用持续皮下注射胰岛素方法建立高胰岛素血症SD大鼠模型(Hins)(N=7),并设立对照组SD大鼠(Con)(N=7)。大鼠处死前测体重,尾静脉采血测空腹血糖(FBG)；心脏穿刺法留取空腹血标本,全自动生化分析仪测总胆固醇(TC),甘油三酯(TG),高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)及低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C),高敏C反应蛋白(hs-CRP); ELISA法血浆空腹胰岛素(Fins),计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR);比色法测血浆NO、高效液相色谱(HPLC)法测血浆ADMA浓度。大鼠处死后立刻开胸,分离升主动脉组织,快速存入液氮,4%甲醛固定。提取大鼠主动脉组织蛋白,Western-Blotting法检测主动脉SREBP-1、SREBP-2, DDAH-1、DDAH-2蛋白表达；Trizol法提取主动脉组织mRNA, RT-PCR法检测上述基因表达。结果：1.Hins组大鼠血浆空腹血糖、胰岛素、HOMA-IR与甘油三酯(TG)均显著高于Con组大鼠(P<0.05),高胰岛素血症SD大鼠模型成功。2. Hins组大鼠体重显著性高于Con组大鼠(P<0.05)。3.两组大鼠胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)无统计学差异。Hins组大鼠ADMA、hs-CRP显著高于Con组(P<0.05),NO显著低于Con组(P<0.05)。4.与Con组大鼠相比,Hins组大鼠主动脉组织SREBP-1、SREBP-2蛋白与基因表达显著升高(P<0.05),DDAH-1、DDAH-2蛋白与基因表达显著下降(P<0.05)。5.主动脉形态学改变：Con组大鼠主动脉内膜光滑,细胞排列整齐,层次清晰；Hins组大鼠主动脉内膜不规整,细胞排列紊乱。结论：1.持续皮下注射胰岛素可制作高胰岛素血症SD大鼠模型,为研究高胰岛素对机体的影响提供了可行的动物模型；2.高胰岛素血症SD大鼠血浆ADMA浓度升高、N0浓度降低,提示内皮功能受损；3.高胰岛素血症SD大鼠主动脉内膜形态发生改变,为内皮受损表现；4.高胰岛素血症SD大鼠主动脉组织SREBP-1、SREBP-2基因与蛋白表达增加,DDAH1、DDAH2基因与蛋白表达降低,可能是高胰岛素损伤血管内皮新机制。第三章高胰岛素对脐静脉内皮细胞DDAH1、DDAH2基因和蛋白表达的影响及其机制研究目的：高胰岛素血症是心血管事件的重要危险因素,我们前期临床试验和动物实验发现：高胰岛素抑制DDAH基因与蛋白表达,促进SREBPs基因与蛋白表达。在此基础上,本章通过细胞实验,进一步证实高胰岛素对内皮细胞DDAH1和DDAH2基因与蛋白表达的影响,并利用siRNA转染技术,抑制SREBP-1和SREBP-2基因表达,以探讨高胰岛素引起内皮细胞损伤的具体机制。方法：1、采用不同浓度的胰岛素处理人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVEC),并分为24小时和48小时处理组,测定葡萄糖摄取率,分析不同浓度胰岛素、作用不同时间对细胞摄取葡萄糖能力的影响。2、顺利完成siRNA转染预实验后,将HUVEC分为两大组,分别用于siRNA转染SREBP-1和SREBP-2实验,siRNA转染SREBP-1实验具体分组如下：(1)A1组：正常培养HUVEC48h;(2) B1组：培基中6×10-8mol/L胰岛素培养HUVEC细胞48h；(3)C1组：HUVEC转染siRNA-NC,6R10-8mol/L胰岛素培养48h；(4)D1组：HUVEC转染siRNA-SREBP1,正常培养48h；(5)E1组：HUVEC转染siRNA-SREBP1,6×10-8mol/L胰岛素培养48h。siRNA转染SREBP-2实验具体分组如下：(6)A2组：正常培养HUVEC48h;(7) B2组：培基中6×10-8mol/L胰岛素培养HUVEC细胞48h;(8)C2组：HUVEC转染siRNA-NC,6×10-8mol/L胰岛素培养48h；(9)D2组：HUVEC转染siRNA-SREBP2,正常培养48h；(10)E2组：HUVEC转染siRNA-SREBP2,6×10-8mol/L胰岛素培养48h。细胞经上述处理完毕后,提取各组mRNA和蛋白,Real-Time PCR检钡SREBP-1、SREBP-2、 DDAH1和DDAH2的基因表达,Western-Blot检测上述蛋白表达。结果：1.低浓度胰岛素促HUVEC摄取葡萄糖,随着胰岛素浓度的升高,HUVEC的葡萄糖摄取率逐渐增高,当胰岛素浓度超过一定范围后,随着胰岛素浓度的升高,HUVEC的葡萄糖摄取率反而随之下降。2.6×10-8mol/L胰岛素孵育HUVEC48h显著诱导HUVEC中的SREBP-1和SREBP-2的基因和蛋白表达(P<0.05),同时显著诱导转染si-RNA-NC组的SREBP-1和SREBP-2的基因和蛋白表达(P<0.05)。3.6×10-8mol/L胰岛素孵育HUVEC48h显著抑制HUVEC的DDAH1、2基因与蛋白表达(P<0.05),同时显著抑制转染si-RNA-NC组的SREBP1、2基因与蛋白的表达(P<0.05)。4.单纯转染siRNA-SREBP-1和siRNA-SREBP-2组不能上调DDAH1、2基因和蛋白表达,但转染了siRNA-SREBP-1、2的高胰岛素处理组DDAH1、2基因与蛋白的下调作用被显著削弱(P<0.05)。结论：1.高浓度胰岛素抑制人脐静脉内皮细胞摄取葡萄糖,可能与损伤有关；2.高浓度胰岛素促进人脐静脉内皮细胞SREBP-1和SREBP-2的基因和蛋白表达,抑制其DDAH1和DDAH2的基因和蛋白表达；3. siRNA沉默人脐静脉内皮细胞SREBP-1和SREBP-2基因,削弱了高胰岛素对DDAH1和DDAH2的基因和蛋白表达的抑制；4. SREBP/DDAH/ADMA途径参与高浓度胰岛素损伤人脐静脉内皮细胞。