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中国水仙(Narcissus tazetta var.chinensis),石蒜科水仙属植物,是多花水仙(Narcissus tazettaL.)的一个变种。由于中国水仙品种较少、花色单一、育种资源匮乏等原因,传统育种方面进展很慢,改良中国水仙依然是广大研究者对水仙研究的重点之一。本研究主要分为两个部分:第一部分围绕’云香水仙’始花期转录组数据分析。第二部分主要围绕’漳州水仙’和’黄花水仙2号’WRKY基因的分子克隆,并通过qRT-PCR分析其在花朵呈现过程中的转录水平。本研究的开展对中国水仙花色育种及品种改良提供了一定的基因资源和理论基础。主要的研究成果如下:1.构建了’云香水仙’始花期花瓣和副冠转录组数据库本试验以’云香水仙’始花期花朵为材料进行转录组测序,在花瓣和副冠中分别获得52,862,192和51,330,652条total clean reads,组装成60,684 和 53,504 条unigene,后筛选得到8866个差异表达基因(DEGs),其中2263个DEGs上调表达(399个DEGs仅在副冠中上调表达),6603个DEGs下调表达(903个DEGs仅在花瓣中下调表达),并被注释到124个KEGG代谢通路,差异基因二次筛选后,共获得10个花色相关的候选差异基因:GGPS,PSY,ZEP,PAL、4CL、F3H2、F3’W,FLS,MYB和WD40转录因子。另外,转录组数据库中并未检测到F3’5’H,和ANR基因序列。2.克隆了MYB和WD4转录因子的cDNA全长从’云香水仙’中分别克隆得到一个MYB和WD40转录因子,命名NtMYB和NtWD40(登录号:KT951723和KU986509)。两个基因的ORF分别为612bp和1020bp,分别编码203和339个氨基酸。氨基酸序列同源性分析表明:’云香水仙’NtMYB蛋白同’漳州水仙’、香蕉、大豆及拟南芥的同源性分别为:89%,78%,79%,73%和64%。NtWD40蛋白同拟南芥、苹果、矮牵牛及苜蓿的同源性分别为:68%、68%、68%和 69%。3.qRT-PCR分析了NtMYB和NtWD40的转录水平通过qRT-PCR分析了NtMYB和NtWD40在‘云香水仙’花苞期、花蕾期、始花期和盛花期花瓣和副冠中的转录水平,结果显示,NtMYB和NtWD40在’云香水仙’开花过程中均有表达,其中NtMYB在花苞期和花蕾期的转录水平较始花期高,盛花期的NtMYB在花瓣中的表达量高于副冠且较始花期呈上升趋势。而NtWD40在’云香水仙’花苞期、花蕾期和始花期中呈上升趋势,盛花期NtWD40的表达量低于始花期的表达量,推测NtMYB和NtWD40可能与’云香水仙’花色形成有关。4.构建了pCAMBIA-1301-NtMYB-GUS和pMDC44-GFP-NtMYB植物表达载体本研究中,通过双酶切法,构建了pCAMBIA-1301-NtMYB-GUS和pMDC44-GFP-NtMYB植物表达载体,这有利于后续NtMYB基因的遗传转化研究。5.克隆了WRKY基因的cDNA全长分别从’黄花水仙2号’和’漳州水仙’中克隆得到一个WRKY基因,命名MtWRKY40a和NtWRK40b(KM516168和KM516169)。两个基因的ORF分别为945bp和951bp,分别编码314和316个氨基酸。两种水仙类型WRKY转录因子推导的氨基酸序列同源比对发现,’黄花水仙2号’同’金盏银台’氨基酸位置存在个别差异,另外本研究构建了其与拟南芥、青蒿、小麦和粳稻等高等植物的系统进化树。6.qRT-PCR分析了NtWRKY因的转录水平通过qRT-PCR分析了NtWRKY4 a和NtWRKY40b在’黄花水仙2号’和’金盏银台’花蕾期、始花期、盛花期和衰败期花瓣和副冠中的转录水平,研究显示,NtWRKY40a和NtWRKY40b在多花水仙开花过程中均有表达,其中,花瓣和副冠中的NtWRKY40a在盛花期和衰败期表达量均最高,较花蕾期和始花期有明显差异。NtWRKY40b在花瓣和副冠的前3个时期的转录水平没有显著差异,而在衰败期表现出较大差异,推测NtWRKY40a和NtWRKY40b可能参与多花水仙花朵的衰老过程。