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肾细胞癌(Renal cell carcinoma,RCC)是泌尿系统中最常见的恶性肿瘤,占成人恶性肿瘤的2-3%。RCC也是最容易产生多药耐药(multidrug resistance,MDR)的肿瘤之一,其临床化疗有效率仅有7-10%,是死亡率最高的泌尿系统肿瘤。肾脏中含有丰富的药物转运体,是介导RCC多药耐药的原因之一。有机阳离子转运体OCT2(organic cation transporter, member 2, SLC22A2)主要表达在肾小管上皮细胞基底侧或顶侧,参与分泌和重吸收的功能,是肾脏中含量最多的有机阳离子转运体。我们实验室前期研究表明,OCT2转运体在RCC患者肿瘤组织中蛋白表达丢失,表观遗传修饰中的DNA甲基化和组蛋白修饰均在OCT2转录抑制中发挥重要作用,且两者之间存在紧密联系,初步推测的信号通路为：MLL1负责催化OCT2基因启动子区域组蛋白甲基化激活信号H3K4me3,转录因子MYC能够招募MLL1,从而促使OCT2基因转录激活。在RCC细胞系及患者中OCT2基因转录抑制,诱因之一是启动子区CpG岛(CpG island,CGI)处在高甲基化水平,致使MYC与OCT2基因启动子区E-Box位点结合受阻,MYC招募能力减弱引起MLL1募集降低,最终导致转录激活信号H3K4me3组蛋白修饰在OCT2基因启动子区显著下降,抑制起始转录,下调蛋白表达水平。本课题在前期研究基础上,验证OCT2基因DNA甲基化与组蛋白甲基化之间的相互作用,完善OCT2基因表观遗传调控机理,丰富OCT2基因调节信号通路。我们通过免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)检测RCC组织芯片(tissue microarray,TMA)中OCT2转运体蛋白表达水平,进一步验证OCT2转运体在RCC中完全沉默。以RCC细胞系786-O细胞为宿主细胞,采用慢病毒包装感染技术成功构建了沉默靶基因MLL1、MYC的细胞模型,用DNA甲基化抑制剂地西他滨(Decitabine, DAC)分别处理两种细胞模型,体外报告基因测定和体内CHIP实验证实了前期推测的信号调控通路。表观遗传调控另一个重要成员是组蛋白乙酰化修饰,组蛋白乙酰化转移酶(histone acetylase, HATs)和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase, HDACs)参与决定组蛋白乙酰化状态。已有研究表明,组蛋白乙酰化水平的紊乱与癌症的发生发展有关,HDAC1与RCC患者组织学分级及临床分期存在相关性。为探究组蛋白乙酰化在OCT2基因转录调控中的机制,以Real Time荧光定量PCR (Real time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)表征RCC患者的肿瘤组织及配对的癌旁肾组织中HDACs的mRNA水平,筛选出在RCC肿瘤组织中mRNA水平显著提高的HDAC7/9作为研究对象。我们以OCT2基因沉默表达的RCC细胞系786-0和769-P细胞为模型,发现组蛋白去乙酰化酶抑制剂Vorinostat (SAHA)不仅能显著增加786-0中OCT2基因的表达,同时也能提高MYC的表达,但对769-P却无影响。而SAHA合用DAC能使两株细胞系中OCT2的mRNA水平上升为单用DAC时的两倍左右,提示两种细胞系存在不同调控机理。我们由此推测RCC细胞系中DNA甲基化和HDACs同时参与OCT2基因的转录调控,且存在某种相互作用,MYC在两者之间可能起到桥梁的作用。采用SAHA处理稳定干扰MYC的786-0细胞,发现SAHA不能改变该细胞模型中的OCT2基因的表达,SAHA抑制HDACs需要MYC参与,证实了组蛋白乙酰化在逆转RCC细胞系中OCT2表达的重要性。另外,RNA干扰(RNAinterference, RNAi)实验表明靶向HDAC7/9的siRNA均能增加RCC细胞系786-0和769-P中OCT2的表达,表明HDAC7/9为SAHA抑制的靶基因,MYC可能招募HDAC7/9,介导DNA甲基化与组蛋白乙酰化之间的相互作用。我们实验室前期研究表明,在细胞水平上表观遗传药物DAC与化疗药物奥沙利铂(Oxaliplatin, Oxa)联合用药能增加RCC细胞系对Oxa的敏感性。为得到更可靠的结论,构建了RCC细胞系(786-O, Caki-1)裸鼠移植瘤模型,采用联合用药治疗,发现通过表观遗传药物DAC逆转RCC中OCT2蛋白的表达,能够增加Oxa在肿瘤组织的蓄积从而杀死肿瘤细胞。通过上述研究表明,两种表观遗传药物DAC与SAHA均能逆转RCC中OCT2基因的低表达,转录因子MYC则作为DNA甲基化与组蛋白修饰(组蛋白甲基化与组蛋白乙酰化)之间的纽带：1.组蛋白甲基化DAC能够降低DNA甲基化水平,提高MYC在OCT2启动子区的富集,增加MLL1的招募,催化H3K4me3修饰信号,促进OCT2基因的转录。2.组蛋白乙酰化RCC患者中HDAC7/9存在异常高表达,靶向干扰HDAC7/9的siRNA能上调OCT2的]mRNA表达,而SAHA依赖于MYC影响OCT2启动子区HDAC7/9的富集,提高OCT2的转录水平。该机制适用于786-0细胞,在769-P细胞中诱导机制还有待研究。DAC与SAHA合用时OCT2的转录水平较单用时显著升高,可见DNA甲基化水平的降低,有助于MYC对HDAC7/9的调节,起到协同作用。基于以上调控机理,我们采用联合用药的方案治疗RCC细胞系移植瘤裸鼠,能显著抑制肿瘤生长。上述结果,可为临床设计增加RCC对化疗药物的敏感性的新治疗方案提供参考。