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本文以30个枇杷品种为实验材料,枇杷叶绿体基因组为研究对象,采用CAPS、RAPD及AFLP分子标记技术对枇杷属植物进行种质鉴定、分子分类及亲缘关系等方面的研究。主要研究结果如下:
针对枇杷叶片富含多糖、多酚类、色素等物质的特点摸索出适合CAPS分析的枇杷基因组DNA提取方法即改良的CTAB法,过程中先用缓冲液洗去多糖、多酚、色素,抽提时增加了在高盐下用水饱和乙醚抽提步骤。及采用高盐pH值法提取了枇杷叶绿体基因组。经RAPD及AFLP分析,提取的枇杷叶绿体基因组能完成实验操作。
CAPS分析操作简单易行在枇杷叶绿体基因组中检测到多态性,但是存在通用引物少,扩增片段过小,多态性位点少等特点,因此在枇杷种属分类上使用受到限制。
优化枇杷cpDNARAPD反应体系。经过反复试验,确定适宜的PCR扩增程序为:94℃,4min;→94℃1min;38℃30S;72℃ 75S;40次循环;→72℃10min;最后在4℃下保存,总体积25μl体系中含dNTP 2.0μl(2.5mmol/l),10xBuffer 2.5μl,引物2.5μl(0.2μmol/l),模板 4.0μl(40ng/μl),Taq 酶 0.6μl(2U/μl)。Mg<2+>浓度3.0μl(20mmol/l),退火温度为38℃。
由RAPD分析结果可知:RAPD存在重复性、稳定性低问题,得到的扩增条带多态性及对品种的区分度较低,5条引物在供试的22个品种中共扩增出293条带,平均每条引物每个品种2.6条。多态性带共99条,多态性比例占33.7%。
选用E-AAC+M-CAC;E-AAC+M-CAG;E-AAC+M-CTC;E-AAG+M-CAC(扩增带信号强度一致性好,条带分布比较均匀)四对引物组合对枇杷属植物的30份种质进行AFLP分析,得到278个扩增位点,其中多态性位点97个,多态性比例平均为34.8%,其区分率达到100%。说明该四对引物用于枇杷属植物的AFLP分析是可行的。
对30份枇杷属植物的种质材料的DNA扩增结果进行UPGMA聚类分析,其相互之间相似系数在0.78-0.90之间,表明此30份枇杷种质之间遗传关系相对比较近。依相似系数0.80的水平,可以将供试的30份种质分为4种类型;聚类分析,发现偏重于传统的以生态型及成熟期划分枇杷种类。本研究结果可以作为枇杷分类的参考。分子水平上,枇杷品种之间的遗传多样性并非形态学性状所体现的那样丰富,说明了枇杷叶绿体基因组遗传多样性比较单调。