水霉病（Saprolegniasis）作为一种淡水水产养殖中最为常见的真菌性疾病,其具有较高的爆发性和感染性,且感染对象广泛。已经给淡水水产养殖业造成了了巨大经济损失。而目前主要依靠化学药物对水霉病进行防治,其中最有效的化学药物孔雀石绿于2002年被禁止使用在水产养殖中,而其他抗水霉化学药物也因药物安全问题广受争议。且化学药物除药物安全问题外一般还设有休药期,并不能应对爆发性、持续性的水霉病。中草药作为一种绿色、无药物残留、低毒或无毒的药物已被广泛使用在食品、化工、临床医学等领域。且依照相关法律和文件的规定,在兽药中中草药制剂属于豁免物质,对环境安全,且无休药期。因此中草药也逐渐应用于水产养殖业中。本研究通过对抗水霉中草药药物筛选,研究其抗水霉的作用机理,并对其进行复配,旨在制备出一种能在生产上使用的,具有较好抗水霉作用的复配药物。也为中草药在其他领域的研究提供可靠的数据支撑。1.抗水霉中草药的筛选以及土荆皮复配药物的制备本研究通过五倍子、土荆皮、乌梅、黄岑等二十余种中草药的水提物对寄生水霉（Saprolegniaparasitica）进行体外抑菌实验,筛选得出五倍子、黄芩、土荆皮对水霉菌有较好抑菌效果(MIC分别为0.488×10-3 g/m L、0.781×10-2g/m L、0.015625 g/m L)。以此为基础,对上述三种中草药单组分活性成分做了体外抑菌试验,其中包括土荆皮甲酸、土荆皮乙酸、黄芩素、黄芩苷、没食子酸等8种中草药中活性物质并通过实验结果筛选几种抑菌效果较好的单组分物质,其中黄芩素、土荆皮甲酸、土荆皮乙酸、川谏素MIC分别为0.125 mg/m L、0.0625 mg/m L、0.0625 mg/m L、0.125 mg/m L。我们对本实验中所用的中草药土荆皮（购自陕西慧科）进行了HPLC单组份化合物含量测定,其中土荆皮甲酸、土荆皮乙酸和土荆皮丙酸的含量分别为;0.00663（μg/g）、0.04001（μg/g）、0.00662（μg/g）。随后试验团队进行中草药中单组分复方抗水霉药物的制备。结果如下:复方中草药单组分活性成分按重量百分比计:黄芩提取物（黄芩素20%～40%）,土荆皮提取物（土荆皮甲酸20%～40%,土荆皮乙酸20%～40%）,川谏子提取物（川谏素10%～20%）。试验证明该配方对于水霉具有明显的抑制效果（MIC均小于0.0625mg/m L）,且MIC浓度均小于复方中各成分MIC。随后实验团队使用这些复方药物针对不同区域的水霉菌株ATCC、EC、02、04、C2、BMY等进行了体外抑菌实验,MIC浓度均小于0.15 mg/m L,这一结果说明上述中草药复方药物具有广谱的抗水霉作用。在之后的研究中,我们利用对抗水霉中草药活性组分的筛选的数据结果,最终选用土荆皮水提物和硫酸亚铁为主要成分,采用Design Expert10软件进行两因素三水平的正交实验,两因素分别为土荆皮水提物和硫酸亚铁,三水平分别是各因素不同浓度（浓度分别为2MIC、MIC、1/2MIC）,经过Design Expert10对正交试验数据进行分析,模型整体呈现显著差异,土荆皮、硫酸亚铁F值分别为0.8811、1.14。Model的F值为3.90。都呈显著差异。Lackof Fit呈不显著差异,说明试验设计合理,数值真实有效。随后利用响应面分析图测得复方药物各成分的最适配比。其最优比例为土荆皮:七水硫酸亚铁=3:1.按此比例配制的复方药物作用水霉菌株时MIC浓度为0.015 g/m L。该配方可制备用于生产实践中的抗水霉中草药复方药物,为新药开发提供理论基础。2.土荆皮水提物抑制水霉生长的药效学研究我们团队在对土荆皮水提物作用水霉孢的体外抑制实验中得出土荆皮水提物作用水霉孢子的MIC、MBC浓度为1.25 g/L、1.25 g/L。随后利用解剖镜、光学显微镜、扫描电镜、透射电镜等手段揭露不同浓度土荆皮水提物抗水霉作用的表型变化特征。起初的解剖镜观察中我们认为土荆皮水提物抑制水霉孢子的萌发是永久性,而对水霉菌丝生长却是可逆的,只要有适宜生长的环境菌丝仍然能够再生长。可有趣的是我们在后续显微镜观察时发现事实并非如此。后期的显微镜观察中我们发现土荆皮水提物对水霉菌丝的生长也是永久性的,并不取决于之后生长环境。我们还发现土荆皮水提物并不是通过破坏水霉孢子细胞壁来抑制其萌发,而是直接通过对细胞内部各细胞结构进行溶解达到抑制其萌发的作用,这与传统的化学药物作用水霉孢子时直接破化其细胞壁的现象不同,且这种抑制效果是永久性的。3.基因、代谢组学分析土荆皮水提物抗水霉的抑制机理本实验是通过1.25 g/L的土荆皮水提物作用寄生水霉菌菌丝后对其产生的代谢产物进行分析,来探究土荆皮水提物抗水霉的抑制机理。本次研究一共筛选出861种差异代谢物,其中空白组与实验组共有差异代谢产物有438个,其中272个差异代谢产物呈上调趋势,166个差异代谢产物呈下调趋势。其中KEGG功能注释共170个,富集到44个通路中。我们从中挑选了差异最显著的10种代谢物进行土荆皮水提物作用水霉菌的机理分析。我们发现这些代谢产物主要与免疫系统基因稳定性、基因转录调节、细胞氧化还原稳态、细胞渗透压等有关,我们推断土荆皮最用水霉后主要通过这些影响来抑制水霉菌的生长与繁殖。我们也对三个存在显著差异的代谢产物通路（嘌呤代谢通路、ABC转运蛋白通路、甘油磷脂代谢通路）进行分析讨论。结果表明这些通路产生的代谢产物多与细胞水盐平衡、炎症反应、毒性物质富集、免疫系统等有关。后续,我们对水霉中5个特定的基因进行了q PCR含量检测。药物作用后,水霉孢子包囊萌发（KDO24919.1）、糖吸收、糖代谢（KDO32861.1）、化学药物主要靶点（KDO25246.1）三个基因表达量受到了明显的抑制。化学药物主要靶点（KDO25246.1）的表达有所提高,推测该基因可能影响外界药物作用水霉菌菌丝靶位点,从而使得水霉对外界药物抗性增强。其中24 h空白组的五个目的基因的表达量均大于24 h药物处理组。说明土荆皮水提物对这五种基因在水霉菌丝中的表达都有着不同程度的抑制效果。4.药物安全性评价本部分研究对土荆皮复配药物进行相关安全性评价。土荆皮复配药物主要成分土荆皮水提物和硫酸亚铁（质量比为3:1）。针对草鱼,利用土荆皮复配药物对其进行急性毒性试验,我们得到该复配药物作用草鱼后24 h、48 h、96 h的LC50分别为9.26 g/L、7.745 g/L、5.930 g/L,安全浓度为0.593 g/L。随后对由不同浓度的复配土荆皮药液中作用96h的草鱼的肠、肝、肌肉、肾、脾做组织病理学切片,结果表明土荆皮复配药物在较高浓度下存在一定的毒性,主要表现在对草鱼肠道和脾脏的影响。实验在3 g/m L的土荆皮水提物的作用下,草鱼肠道表面的纹状缘光滑肠绒毛排列疏而短,脾脏中淋巴小结结构基本破坏。在6 g/m L浓度的作用下,肠道出现破损脱落、空泡化严重的现象,脾脏出现大量的出血点。土荆皮复配药物预防效果实验表明土荆皮含量达1.25 g/L的土荆皮复配药物对水霉病的预防效果较好。本实验筛选出了具有较好抗水霉作用的中草药——土荆皮,并对其进行复配研究,得出最适配方。随后揭示了土荆皮抑制水霉生长的作用机理。并对复配药物进行安全性评价,测定复配药物稳定性,得出安全浓度。最终得出了最有效的防治水霉病的土荆皮复配药物成分配比为（土荆皮1.25 g;硫酸亚铁0.42 g）每升水体。