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目的本实验通过研究不同浓度内毒素（脂多糖）对体外培养的大鼠成骨细胞凋亡的影响，筛选出合适的脂多糖浓度建立脂多糖诱导成骨细胞凋亡模型，进而探讨脂多糖诱导成骨细胞凋亡的作用机制，为感染所致骨坏死的发病机制提供实验依据。方法1、采用酶交替消化法提取出生24h内SD大鼠颅骨成骨细胞，取第3代细胞做检测。2、成骨细胞的鉴定：(1)倒置相差显微镜下观察培养1d、7d、14d的原代细胞及第3代的成骨细胞的细胞形态。(2)取培养20d的第3代细胞，茜素红染色，置于倒置显微镜下观察。(3)取培养20d的第3代细胞，四环素荧光标记，荧光显微镜下观察。(4)取培养20d的第3代细胞，碱性磷酸酶染色，倒置显微镜下观察。3、 LPS诱导成骨细胞凋亡模型的建立按0.00、0.01、0.10、1.00、10.00、100.00μg/ml浓度的LPS分组，采用MTT法检查细胞增殖活性，流式细胞仪检测细胞凋亡率，筛选诱导成骨细胞凋亡的合适LPS浓度，并以该浓度建立成骨细胞凋亡模型。4、实验分组：(1)对照组：未处理的成骨细胞(2)LPS组：10.00μg/ml LPS预处理的成骨细胞(3)LPS+PMA组：10.00μg/ml LPS+100nmol/L PMA预处理的成骨细胞(4)LPS+Rottlerin组：10.00μg/ml LPS+2μmol/L Rottlerin预处理的成骨细胞5、 MTT法检测各组细胞增殖活性； Annexin-V-FITC/PI染色流式细胞术和吖啶橙/溴乙锭（AO/EB）荧光染色法检测细胞凋亡；采用Western blot法检测凋亡相关蛋白Caspase-3、 Bcl-2、 Bax及磷酸化PKC-δ的表达情况。结果1、大鼠成骨细胞的鉴定本法分离的细胞24h内贴壁，呈长梭形、鳞片形、三角形等，主要为长梭形，胞浆突起，向外伸展；7d后，细胞多数呈鳞片形，体较大，多伪足，胞浆丰富，胞核较大，呈“铺路石”样；继续培养，可见局部多层生长，并有黑色钙结节生成。经四环素标记，荧光显微镜下观察，金黄色亮区为钙结节。经茜素红染色，倒置显微镜下观察，暗红色区为钙结节。碱性磷酸酶染色，胞质呈深灰色，细胞间呈沟壑状。2、诱导成骨细胞凋亡的合适LPS浓度筛选MTT检测结果显示，在0.01～10.00μg/ml浓度的LPS组OD值较对照组增大，细胞增殖活性增强，其中1.00μg/ml组细胞OD值最大，对促进细胞增殖活性作用最强。100.00μg/ml组细胞OD值较对照组低，细胞增殖活性减弱。流式细胞仪检测结果显示，平均凋亡率随着LPS浓度增加而增加，分别为3.31%、5.25%、14.02%、25.61%、68.54%。选择10.00μg/ml LPS作为合适药物浓度诱导成骨细胞凋亡。3、大鼠成骨细胞增殖活性的MTT法检测结果LPS组与空白对照组比较成骨细胞增殖活性降低，差异具有显著性意义(p<0.05)；LPS+PMA组与LPS组比较成骨细胞增殖活性降低，差异具有显著性意义(p<0.05)；LPS+Rottlerin组与LPS组比较细胞增殖活性增高，差异具有显著性意义(p<0.05)。4、流式细胞仪检测各组细胞凋亡率流式细胞仪检测结果显示对照组细胞凋亡率（%）3.51±0.46低于Rottlerin预处理组细胞凋亡率（%）10.50±0.35，差异具有统计学意义（t=6.421，p<0.05）；Rottlerin预处理组细胞凋亡率低于单独LPS处理组细胞凋亡率（%）19.03±0.54，差异有统计学意义（t=5.315，p<0.05）；单独LPS处理组细胞凋亡率低于PMA预处理组细胞凋亡率（%）26.73±0.69，差异有统计学意义（t=5.956，p<0.05）。5、吖啶橙/溴乙锭（AO/EB）双染色法检测各组凋亡情况AO/EB双荧光检测结果显示，对照组凋亡率（%）3.8±1.03低于LPS+Rottlerin组（%）14.5±1.27，LPS+Rottlerin组低于LPS组（%）18.9±1.45， LPS组低于LPS+PMA组（%）31.4±1.71，差异有统计学意义（p<0.05）。6、 Western blot检测凋亡相关蛋白及PKC-δ表达情况Western blot检测结果显示各实验组与对照组比较磷酸化PKC-δ、Caspase-3、 Bax表达上调， Bcl-2表达量下调；磷酸化PKC-δ、Caspase-3、 Bax在LPS＋Rottlerin组、 LPS组、 LPS+PMA组中依次增加，而Bcl-2表达量则依次下调。结论1、低浓度的LPS可使细胞增殖活性增强，其中1.00μg/mlLPS促进细胞增殖活性作用最强；高浓度的LPS使成骨细胞增殖活性减弱。2、10.00μg/ml LPS可使凋亡成骨细胞中磷酸化PKC-δ、Caspase-3、 Bax表达水平增加， Bcl-2表达水平降低3、一定浓度的LPS可以诱导体外培养成骨细胞发生凋亡，LPS诱导的成骨细胞凋亡与PKC-δ的磷酸化相关，PMA可通过提高PKC-δ的磷酸化水平增强LPS诱导的成骨细胞凋亡，Rottlerin可通过抑制PKC-δ的磷酸化减少LPS诱导的成骨细胞凋亡。