研究目的:类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种常见的炎症性关节炎,特征是炎性滑膜炎,目前机制尚未明确。肿瘤坏死因子α(TNF-α)是目前被认为参与炎症反应最重要的细胞因子,抑制TNF-α是目前治疗RA的主要手段,但其治疗方法存在局限性,副作用多且价格昂贵;并且临床中上市一种新药物需要耗费大量的时间与金钱。因此快速高效的寻找一种新的疗效好且安全的药物是目前亟待解决的问题。在这种情况下,我们采用“老药新用”的方法,旨在从己上市的药物中发现并赋予其新的治疗指征。研究方法:在筛选中,我们分别使用了稳转NF-κB β内酰胺酶报告基因的THP-1细胞系、瞬转NF-κB荧光素酶报告基因的RAW264.7细胞系和TNF-tg、NF-κB荧光素酶双表达的转基因小鼠作为工具筛选了 987种FDA已批准的药物,经过体内外3轮筛选,我们找到了两种可能抑制TNF-α活性的药物:非索非那定(Fexofenadine,FFD)和特非那定(Terfenadine,TFD)。在体外验证中,我们首先采用RNA-seq技术检测了全基因的表达变化,并通过转录因子分析的方式明确药物所干预的转录因子为NF-κB;我们同时应用ELISA和qRT-PCR等实验,在3种不同的细胞系中检测了 TNF-α下游炎症因子(IL-1β、IL-6和NOS-2)的表达改变;为了更加确认药物对NF-κB的作用,我采用免疫荧光、EMSA和Western blot等技术检测分别检测了NF-κB的转位及结合活性。在体内实验中,我们采用了两种类风湿性关节炎模型:TNF过表达(TNF-ααtransgentic,TNF-tg)转基因小鼠自发性关节炎模型和胶原诱导关节炎(Collagen induced arthritis,CIA)模型。每种模型分别设立了预防实验及治疗实验组,每天观察、评分并口服灌胃给药。处死小鼠后,首先通过多种行为学评分鉴定药物治疗效果;分别通过 H&E 染色检查小鼠关节处炎症程度及软骨下骨的破坏程度;用TRAP染色观察骨质中破骨细胞的形成;且用Safranin O染色检测关节表面软骨的磨损;除此之外,我们利用micro-CT技术扫描了小鼠关节部分,更直观的观察小鼠骨质表面的骨破坏情况;最后通过ELISA的方法检测了小鼠血清中炎症因子的表达情况。在机制探究中,我们首先应用小干扰RNA技术敲减了组胺受体1,验证并排除了 FFD和TFD对目前己知靶点的依赖性。然后通过流式细胞术和solid phase binding技术,排除了药物是依赖抑制TNF-α与TNFR1受体结合发挥作用的可能。因此,我们考虑到药物可能进入到细胞质中,然后结合了胞质中的蛋白产生作用。我们采用药物亲和反应靶点稳定性测定(DARTS)实验,即经过蛋白酶消化、跑胶、考马斯亮蓝染色、质谱分析等技术找到了其可能的靶蛋白-胞浆型磷脂酶A2(cPLA2)。为了验证该结果,我们设计并应用了细胞热位移测定(CETSA)技术确认了该药物与蛋白的结合反应。随后我们利用了计算机模拟技术,即docking法对FFD和TFD在cPLA2蛋白上的的结合位点进行预测,然后对预测结果采用亚克隆技术和点突变技术进行了精确的验证。最后,我们使用Western blot法对cPLA2的磷酸化进行检测;且运用ELISA法对cPLA2的酶活性和其代谢产物花生四烯酸(AA)的产生进行了检测,并设计了 AA干预实验。最后,我们用crispr-cas9技术对FFD和TFD在治疗作用中对cPLA2的依懒性进行了探究。实验结果:1.在第一轮筛选过程中,我们应用稳定转染细胞系,重复了 3次实验,最终得到28种药物进入第二轮筛选;第二轮换用瞬转细胞筛选,再次排除20种药物,剩余8种药物;最后我们设计了第三轮动物筛选,给TNF-tg:NF-KB荧光素酶双表达转基因小鼠每天药物灌胃治疗一周后,通过小动物活体成像技术,以及排除了部分有毒或抗癌药物后,成功筛选出2种可能药物。最终:通过体内外3轮筛选实验,我们从987种FDA批准的药物组成的药物库中筛选到了可以拮抗TNF-αα激活NF-κB的小分子化合药物TFD和其活性产物FFD。其中TFD是第一代抗组胺药物,FFD是第二代抗组胺药物。2.为了验证上述药物的抗炎效果,首先,我们用RNA-seq技术检测了TNF-α诱导及FFD或TFD干预治疗后的巨噬细胞中的基因变化,我们发现TNF-α诱导的许多炎症相关因子均可以被FFD和TFD抑制;转录因子分析结果证实:NF-κB可以被该药物抑制。随后,我们用3种不同的原代细胞或细胞系,检测了 TNF-α和FFD或TFD干预后炎症因子的表达情况,发现IL-1β和IL-6均在治疗后下调;除此之外,为了探究药物对NF-κB的影响,我们设计了NF-κB转位及活性检测,均发现FFD和TFD不仅可以抑制TNF-α诱导的NF-κB转位,还抑制了 NF-κB的结合活性。3.我们同样构建了2种炎症性关节炎动物模型:TNF-tg白发性关节炎和CIA模型,这两种模型均为模拟类风湿性关节炎的常用模型。通过每天对小鼠的治疗和观察以及行为学评分,我们发现药物治疗后小鼠的炎症反应、肿胀程度均得到明显改善,发病率也得到有效控制。此外,组织学染色的结果同样发现药物治疗组的症状明显轻于对照组:H&E染色中炎症细胞的数目明显减少,软骨下骨损伤也显著减轻;TRAP染色中药物治疗组破骨细胞的数目明显少于对照组;Safranin O染色中治疗组关节表面软骨细胞数目及软骨层数均有所改善。Micro-CT技术更直观的证明了药物治疗对骨质丢失的有效控制。血清中的炎症因子同体外实验一样,均能够被药物明显抑制。4.为了探究FFD与TFD的治疗机制,我们首先排除了其对HIR1,即FFD和TFD已知靶蛋白在抗炎作用中的依赖性。实验发现:即使敲减了HIR1的表达,药物仍能显著抑制TNF信号。此外,我们通过流式细胞术和solid phase binding实验证实FFD与TFD不能够抑制TNF-a.与TNFR1的结合。由此我们推测,药物可能穿过细胞膜进入细胞质,结合质蛋白并发挥作用。为此,我们采用DARTS实验结合质谱分析,发现了cPLA2为其可能的作用靶点。经过DARTS和CETSA等方法的联合验证,证实cPLA2确实为药物结合靶点。随后,我们采取分子对接预测(docking)的方法发现:FFD与TFD在cPLA2上可能的结合位点为第505号氨基酸(ser505)。为了证明该预测的准确性,我们首先应用亚克隆技术(sub-clone)从PLA2G4A(转录翻译cPLA2的基因名称)的N端和C端开始,逐个敲除结构域,构建质粒并转染后应用DARTS实验证实:药物结合的结构域为CD2(Catalytic domain 2),这与我们的预测结果一致。为了更进一步、更精确的证明,我们又采用点突变(site-directed mutagenesis)的技术将PLA2G4A的505号氨基酸(ser505)突变为a1a,并再次用DARTS验证,结果表明:突变后,药物不能与cPLA2结合。因此我们得到结论:cPLA2是FFD和TFD作用的新靶点,且结合位点是CD2结构域上的ser505。5.FFD和TFD可以结合cPLA2,但是药物的抗炎作用是否通过cPLA2?ser505是cPLA2上一个重要的磷酸化位点,我们首先验证了 FFD与TFD是否影响cPLA2磷酸化,实验结果证实:FFD和TFD可以显著抑制cPLA2的磷酸化。花生四烯酸(arachidonic acid,AA)作为cPLA2的酶解产物,是一个重要的致炎因子。通过对cPLA2的酶活检测和其酶解产物AA含量的检测,我们发现药物可以抑制cPLA2的酶活性,同时减少AA的产生。反之,当我们用AA刺激细胞产生炎症时,FFD和TFD的治疗作用随之消失。以上结果表明:药物的作用靶点为cPLA2,对其下游产物诱导的炎症无抑制作用。最后,我们通过对cPLA2的敲除证实了FFD和TFD对TNF-α的拮抗作用确实是依赖于cPLA2的。结论及意义:通过上述实验:我们从987种FDA批准的药物中发现了FFD和TFD可以作为抑制TNF-αα的小分子化合物。经过多种体外实验和两种动物模型的验证,明确了其抑制TNF-α活性的作用。另外,我们发现了其新的靶蛋白cPLA2。并且该抗炎作用是依赖于cPLA2发挥作用。在此实验中,我们发现了 FFD和TFD是TNF-α的拮抗剂,能够用来治疗各种由TNF-cα导致的疾病。一方面:FFD和TFD是一种小分子药物,相比于蛋白类药物、有更少的副作用、价格便宜、容易获取、服用方便。另一方面:可以避免前三期临床试验,减少研发投入和时间。为临床治疗类风湿关节炎提供了新的思路和可能的方式。除此之外,我们同样发现:FFD和TFD也是cPLA2的抑制剂。因此,FFD和TFD不仅可以用来治疗各类TNF-α相关的疾病,同样可以用来治疗cPLA2相关的疾病。