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第一部分脓毒症免疫抑制期小鼠脏器变化与TREX1的表达
目的：本研究旨在探讨脓毒症免疫抑制期小鼠不同脏器变化，以及TREX1在小鼠脓毒症免疫抑制期可能存在的作用及相关机制。
方法：本实验采用雄性8-10周C57BL/6J小鼠，以中重度盲肠结扎穿孔(cecal ligation and puncture，CLP)与LPS构建的脓毒症小鼠模型作为研究对象。CLP模型在小鼠麻醉后，腹部正中切口，充分暴露盲肠，在距回盲瓣1/3处，4-0丝线结扎盲肠，并确保结扎完全；20G穿刺针在结扎远端穿孔2次，挤出少量粪便以保证穿孔的通畅。另一组小鼠腹腔注射10mg/KgLPS以构建LPS脓毒症模型。将所有小鼠分为四个组别：①Sham组：小鼠仅暴露盲肠，无结扎穿孔；②LPS组：腹腔注射10mg/KgLPS24h；③CLP组：建立盲肠结扎穿孔脓毒症动物模型8d；④CLP+LPS(即“二次”打击)组：盲肠结扎穿孔术后7d，存活小鼠经腹腔注射10mg/KgLPS进行“二次”打击并观察24h；取Sham组、LPS组、CLP组以及“二次”打击小鼠的肺、肝和肾组织，HE染色观察脏器的损伤情况；将四组小鼠脾脏制备成脾细胞悬液，WesternBlot检测脾脏中TREX1、STING及TBK1蛋白的变化情况。
结果：相比于假手术组，10mg/kgLPS诱导24h的脓毒症小鼠肺部仅出现轻度肺泡壁增厚，CLP8d的小鼠出现肺泡壁增厚、充血等改变，LPS“二次”打击的CLP小鼠肺部情况明显加重，出现明显肺泡壁增厚、出血、肺泡塌陷破坏；小鼠肝脏随着脓毒症加重，肝小叶结构被逐渐破坏，“二次”打击小鼠肝细胞出现炎性细胞浸润和坏死；相比LPS单纯刺激组，CLP组小鼠肾脏上皮细胞紊乱，间质水肿加重，“二次”打击小鼠肾小管空泡变性、肾小球呈严重固缩样改变；“二次”打击小鼠脏器变化符合脓毒症免疫抑制期的变化特征。WesternBlot结果表明，CLP8d小鼠脾脏TREX1相比于Sham组表达增加(P<0.05)；LPS“二次”打击CLP术后的小鼠脾脏，相比于Sham组，TREX1表达更加显著(P<0.01)。相比于LPS24h的小鼠，CLP8d以及“二次”打击小鼠脾脏内STING表达明显减少(P<0.05)。相比于LPS24h的小鼠，CLP8d以及“二次”打击组的小鼠脾脏内TBK1表达明显减少(P<0.01)。
结论：在脓毒症发生发展过程中，小鼠肺、肝、肾出现明显损伤；TREX1在脓毒症小鼠脾脏中，从脓毒症早期到免疫抑制期表达逐渐增加，而STING、TBK1则相比脓毒症早期，在脓毒症免疫抑制期表达下调。这可能是TREX1导致脓毒症免疫抑制的分子机制。
第二部分脓毒症免疫抑制期巨噬细胞中DNA损伤对TREX1的影响
目的：探讨DNA损伤及相关细胞因子分泌与TREX1的关系，以及TREX1在巨噬细胞脓毒症免疫抑制期的变化。
方法：本实验以鼠单核/巨噬细胞Raw264.7为主要研究对象，随机将细胞分为：①Ctrl组；②LPS4h组；③LPS15h组；④LPS15+4h(即“二次”打击)组；其中Ctrl组用DMEM培养基处理21h；LPS4h组先用DMEM培养基预处理Raw264.7细胞17h，再用1μg/mLLPS刺激Raw264.7细胞4h；LPS15h组先用10ng/mLLPS刺激Raw264.7细胞15h，再用DMEM培养基处理Raw264.7细胞6h；LPS15+4h组在10ng/mLLPS刺激Raw264.7细胞15h以诱导巨噬细胞耐受或“麻痹”后，DMEM培养基清洗2h，再用LPS1μg/mLLPS刺激4h进行“二次”打击；ELISA检测脓毒症不同时期的Raw264.7细胞上清液中炎症因子TNF-α与负向调控细胞因子IL-10的表达量；免疫荧光染色观察DNA损伤标记物γH2A.X与TREX1表达关系，WesternBlot检测各组Raw264.7细胞中TREX1、STING、TBK1的表达。
结果：ELISA结果表明，与Ctrl组相比，LPS4h与LPS15h组Raw264.7细胞上清液中TNF-α分泌显著增加(P<0.01)；而LPS15h+4h组(即“二次”打击组)相对于LPS15h组，TNF-α表达则明显下降(P<0.01)。相比于Ctrl组，Raw264.7细胞LPS4h组与LPS15h组上清液中IL-10分泌减少(P<0.01)；LPS15+4h组(即“二次”打击组)的Raw264.7细胞相比LPS15h组IL-10表达明显增加(P<0.01)。免疫荧光结果显示，LPS15h以及LPS“二次”打击组细胞中TREX1荧光强度相比于Ctrl组以及LPS4h组有明显增加，同时DNA损伤标记物γH2A.X也随着LPS诱导时间增长而荧光强度增强。WesternBlot结果显示，相比Ctrl组，巨噬细胞TREX1随着LPS刺激时间增长而表达逐渐增多(P<0.01)；LPS15h组Raw264.7细胞相比LPS4h组STING表达明显减少(P<0.01)；相比LPS4h组，LPS15+4h组(即“二次”打击组)的Raw264.7细胞STING表达减少(P<0.05)。LPS15h和LPS15+4h组(即“二次”打击组)的Raw264.7细胞相比LPS4h组TBK1表达减少(P<0.05)。
结论：在Raw264.7巨噬细胞中，TNF-α在脓毒症早期表达增多，免疫抑制期表达减少；IL-10在脓毒症早期表达减少，而免疫抑制期则表达增加。DNA损伤与TREX1表达在脓毒症免疫抑制期有明显增加。在Raw264.7巨噬细胞中，TREX1随着脓毒症进展，表达逐渐增加；而相比脓毒症早期，STING和TBK1在脓毒症免疫抑制期表达减少，TREX1在脓毒症免疫抑制发生发展过程中扮演了重要角色。
目的：本研究旨在探讨脓毒症免疫抑制期小鼠不同脏器变化，以及TREX1在小鼠脓毒症免疫抑制期可能存在的作用及相关机制。
方法：本实验采用雄性8-10周C57BL/6J小鼠，以中重度盲肠结扎穿孔(cecal ligation and puncture，CLP)与LPS构建的脓毒症小鼠模型作为研究对象。CLP模型在小鼠麻醉后，腹部正中切口，充分暴露盲肠，在距回盲瓣1/3处，4-0丝线结扎盲肠，并确保结扎完全；20G穿刺针在结扎远端穿孔2次，挤出少量粪便以保证穿孔的通畅。另一组小鼠腹腔注射10mg/KgLPS以构建LPS脓毒症模型。将所有小鼠分为四个组别：①Sham组：小鼠仅暴露盲肠，无结扎穿孔；②LPS组：腹腔注射10mg/KgLPS24h；③CLP组：建立盲肠结扎穿孔脓毒症动物模型8d；④CLP+LPS(即“二次”打击)组：盲肠结扎穿孔术后7d，存活小鼠经腹腔注射10mg/KgLPS进行“二次”打击并观察24h；取Sham组、LPS组、CLP组以及“二次”打击小鼠的肺、肝和肾组织，HE染色观察脏器的损伤情况；将四组小鼠脾脏制备成脾细胞悬液，WesternBlot检测脾脏中TREX1、STING及TBK1蛋白的变化情况。
结果：相比于假手术组，10mg/kgLPS诱导24h的脓毒症小鼠肺部仅出现轻度肺泡壁增厚，CLP8d的小鼠出现肺泡壁增厚、充血等改变，LPS“二次”打击的CLP小鼠肺部情况明显加重，出现明显肺泡壁增厚、出血、肺泡塌陷破坏；小鼠肝脏随着脓毒症加重，肝小叶结构被逐渐破坏，“二次”打击小鼠肝细胞出现炎性细胞浸润和坏死；相比LPS单纯刺激组，CLP组小鼠肾脏上皮细胞紊乱，间质水肿加重，“二次”打击小鼠肾小管空泡变性、肾小球呈严重固缩样改变；“二次”打击小鼠脏器变化符合脓毒症免疫抑制期的变化特征。WesternBlot结果表明，CLP8d小鼠脾脏TREX1相比于Sham组表达增加(P<0.05)；LPS“二次”打击CLP术后的小鼠脾脏，相比于Sham组，TREX1表达更加显著(P<0.01)。相比于LPS24h的小鼠，CLP8d以及“二次”打击小鼠脾脏内STING表达明显减少(P<0.05)。相比于LPS24h的小鼠，CLP8d以及“二次”打击组的小鼠脾脏内TBK1表达明显减少(P<0.01)。
结论：在脓毒症发生发展过程中，小鼠肺、肝、肾出现明显损伤；TREX1在脓毒症小鼠脾脏中，从脓毒症早期到免疫抑制期表达逐渐增加，而STING、TBK1则相比脓毒症早期，在脓毒症免疫抑制期表达下调。这可能是TREX1导致脓毒症免疫抑制的分子机制。
第二部分脓毒症免疫抑制期巨噬细胞中DNA损伤对TREX1的影响
目的：探讨DNA损伤及相关细胞因子分泌与TREX1的关系，以及TREX1在巨噬细胞脓毒症免疫抑制期的变化。
方法：本实验以鼠单核/巨噬细胞Raw264.7为主要研究对象，随机将细胞分为：①Ctrl组；②LPS4h组；③LPS15h组；④LPS15+4h(即“二次”打击)组；其中Ctrl组用DMEM培养基处理21h；LPS4h组先用DMEM培养基预处理Raw264.7细胞17h，再用1μg/mLLPS刺激Raw264.7细胞4h；LPS15h组先用10ng/mLLPS刺激Raw264.7细胞15h，再用DMEM培养基处理Raw264.7细胞6h；LPS15+4h组在10ng/mLLPS刺激Raw264.7细胞15h以诱导巨噬细胞耐受或“麻痹”后，DMEM培养基清洗2h，再用LPS1μg/mLLPS刺激4h进行“二次”打击；ELISA检测脓毒症不同时期的Raw264.7细胞上清液中炎症因子TNF-α与负向调控细胞因子IL-10的表达量；免疫荧光染色观察DNA损伤标记物γH2A.X与TREX1表达关系，WesternBlot检测各组Raw264.7细胞中TREX1、STING、TBK1的表达。
结果：ELISA结果表明，与Ctrl组相比，LPS4h与LPS15h组Raw264.7细胞上清液中TNF-α分泌显著增加(P<0.01)；而LPS15h+4h组(即“二次”打击组)相对于LPS15h组，TNF-α表达则明显下降(P<0.01)。相比于Ctrl组，Raw264.7细胞LPS4h组与LPS15h组上清液中IL-10分泌减少(P<0.01)；LPS15+4h组(即“二次”打击组)的Raw264.7细胞相比LPS15h组IL-10表达明显增加(P<0.01)。免疫荧光结果显示，LPS15h以及LPS“二次”打击组细胞中TREX1荧光强度相比于Ctrl组以及LPS4h组有明显增加，同时DNA损伤标记物γH2A.X也随着LPS诱导时间增长而荧光强度增强。WesternBlot结果显示，相比Ctrl组，巨噬细胞TREX1随着LPS刺激时间增长而表达逐渐增多(P<0.01)；LPS15h组Raw264.7细胞相比LPS4h组STING表达明显减少(P<0.01)；相比LPS4h组，LPS15+4h组(即“二次”打击组)的Raw264.7细胞STING表达减少(P<0.05)。LPS15h和LPS15+4h组(即“二次”打击组)的Raw264.7细胞相比LPS4h组TBK1表达减少(P<0.05)。
结论：在Raw264.7巨噬细胞中，TNF-α在脓毒症早期表达增多，免疫抑制期表达减少；IL-10在脓毒症早期表达减少，而免疫抑制期则表达增加。DNA损伤与TREX1表达在脓毒症免疫抑制期有明显增加。在Raw264.7巨噬细胞中，TREX1随着脓毒症进展，表达逐渐增加；而相比脓毒症早期，STING和TBK1在脓毒症免疫抑制期表达减少，TREX1在脓毒症免疫抑制发生发展过程中扮演了重要角色。