【摘 要】
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第一部分：EFGR基因家族shRNA真核表达质粒的构建目的：构建针对EGFR家族的shRNA干扰质粒表达载体，为本课题下一步研究提供有力工具。方法：选择放疗不敏感的卵巢癌细胞SKOV3中高表达的EGFR家族同源性基因为靶基因，根据shRNA的设计原则，设计实验组及对照组shRNA。体外合成2段编码短发夹RNA序列的DNA单链，退火，克隆到相应载体pGensil-1的pol Ⅲ启动子下游。分别命名为
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第一部分：EFGR基因家族shRNA真核表达质粒的构建目的：构建针对EGFR家族的shRNA干扰质粒表达载体，为本课题下一步研究提供有力工具。
方法：选择放疗不敏感的卵巢癌细胞SKOV3中高表达的EGFR家族同源性基因为靶基因，根据shRNA的设计原则，设计实验组及对照组shRNA。体外合成2段编码短发夹RNA序列的DNA单链，退火，克隆到相应载体pGensil-1的pol Ⅲ启动子下游。分别命名为pGensil-1-E及pGensil-1-C经限制性内切酶酶切和DNA测序进行鉴定。
结果：经酶切和DNA测序鉴定结果完全符合设计要求，成功构建了EGFR家族同源性基因的RNA干扰表达载体，pGensil-1-E及pGensil-1-C为下一步体外、体内实验奠定了基础。
结论：本实验应用RNAi技术，成功构建了EGFR家族同源性基因的RNA干扰表达载体，pGensil-1-E及pGensil-1-C 目的：将重组质粒载体转染卵巢癌SKOV3细胞，观察其对SKOV3增殖活性的影响。
方法：利用脂质体2000转染细胞，G418筛选建立稳定转染细胞系。利用MTT检测细胞增殖活性。利用RT-PCR、Western Blot检测稳定细胞mRNA、蛋白水平变化。
结果：建立了RNA干扰重组质粒载体稳定转染SKOV3细胞。MTT：pGensil-1-E组较对照组细胞增殖抑制率24h、48h、72h分别为：59.7％、81.2％、87.8％。RT-PCR：pGensil-1-E组较对照组细胞瞬时转染及稳定转染HER2 mRNA表达率下降至：32.9％、21.7％。WesternBlot：pGensil-1-E组较对照组细胞稳定转染P185表达率下降至：21.8％。
结论：获得了在mRNA水平及蛋白水平上HER2表达均受到明显抑制的稳定转染卵巢癌SKOV3细胞系。为本课题下一步卵巢癌放疗增敏实验提供理论指导和实验依据。
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