大豆球蛋白是豆粕中最主要的蛋白组分以及抗营养因子。目前研究发现,大豆球蛋白可降低部分鱼类的生产性能和肠道的消化吸收能力,但其对鱼类肠道结构完整性的影响研究很少,且作用机制尚不清楚。本研究首先考察了大豆球蛋白对草鱼生长性能、肠道形态、肠道结构完整性的影响,并探究了大豆球蛋白对草鱼肠道氧化损伤、细胞凋亡和紧密连接的影响;第二,通过体内外消化试验探究了大豆球蛋白在草鱼上的消化代谢,并探索了不同时间大豆球蛋白的消化产物对肠道上皮细胞结构完整性的影响,利用分子筛技术对其中负面效应最强的产物进行了分离,进一步探索其中不同分离峰对草鱼肠道上皮细胞结构完整性的影响,找出了消化产物中的可能效应物;第三,研究了大豆球蛋白及其消化产物效应物对草鱼肠道上皮细胞活性氧产生及清除能力的影响和相关机制;第四,探索了大豆球蛋白及其消化产物效应物对草鱼肠道上皮细胞凋亡和相关信号的影响,进一步研究了p38-MAPK和JNK信号在其促凋亡中的作用。主要研究内容和结果如下:1.大豆球蛋白对幼草鱼生长性能和肠道结构完整性的影响试验一选取360尾幼草鱼（13.75±0.07g）,随机分为三个处理组,包括对照组,8%大豆球蛋白组,8%大豆球蛋白+1.2%谷氨酰胺组,每个处理三个重复,进行为期7周的生长试验,试验结果如下:1.1大豆球蛋白对幼草鱼生长性能和肠道结构完整性的影响8%大豆球蛋白显著降低了幼草鱼的摄食量、末重、日增重、特异生长率、饲料系数及饲料效率（P＜0.05）;显著提高了幼草鱼血清中二胺氧化酶的活性和D-乳酸的含量（P＜0.05）;组织学观察发现大豆球蛋白引起了幼草鱼中肠核移位以及后肠淋巴细胞增生。结果表明:大豆球蛋白降低了幼草鱼的生产性能,破坏了草鱼肠道的结构完整性。1.2大豆球蛋白对幼草鱼肠道氧化损伤,活性氧产生及清除的影响研究结果发现大豆球蛋白对幼草鱼前、中、后三个肠段氧化损伤状态,活性氧产生及清除的影响存在差异:前肠:大豆球蛋白对前肠的活性氧及氧化损伤产物的含量无显著影响（P≥0.05）;活性氧产生方面,显著降低了前肠NADPH氧化酶（NOX）和黄嘌呤氧化酶（XOD）的酶活性（P＜0.05）,即降低了活性氧产生能力;活性氧清除方面:大豆球蛋白降低了草鱼前肠活性氧清除能力和部分抗氧化酶的活力,但对Nrf2信号无显著影响。结果说明,大豆球蛋白同时降低了草鱼前肠活性氧产生和清除能力,故其活性氧含量不变,无氧化损伤。中肠和后肠:大豆球蛋白显著提高了中肠和后肠的活性氧和氧化损伤产物含量（P＜0.05）;活性氧清除方面,大豆球蛋白均显著降低了中肠和后肠的活性氧清除能力和部分抗氧化酶的活力,并分别在中肠和后肠下调了部分抗氧化酶m RNA的水平,同时抑制了Nrf2的蛋白水平和其核移位状态;活性氧产生方面,大豆球蛋白显著中肠NOX的酶活性（P＜0.05）、后肠NOX和XOD的酶活性,而对中肠XOD酶活性无显著影响（P≥0.05）,在中肠上调了NOX1和NOX2及其对应胞质配体的表达,在后肠仅上调了NOX1及其对应胞质配体的表达。以上结果表明:大豆球蛋白在幼草鱼中肠和后肠均显著提高了活性氧含量并造成了氧化损伤,降低了由Nrf2信号调控的抗氧化能力,但调控活性氧产生方式存在差异;在中肠,与上调的活性氧产生信号NOX1和NOX2有关（不通过XOD）,在后肠,则与上调的NOX1和XOD（不通过NOX2）有关。1.3大豆球蛋白对幼草鱼肠道细胞凋亡的影响研究结果发现大豆球蛋白对幼草鱼前、中、后三个肠段的凋亡状态和凋亡途径的影响存在差异:在前肠中,大豆球蛋白对草鱼DNA片段化、caspase3、8和9的活性和m RNA水平以及胞质中线粒体释放的细胞色素c蛋白水平均无显著影响（P≥0.05）,表明大豆球蛋白对草鱼前肠细胞凋亡状态没有影响。在中后肠中,大豆球蛋白加剧了DNA片段化,并显著提高中肠和后肠caspase-3、8和9的活性,同时显著上调中肠caspase-3的m RNA水平,后肠caspase-3、8和9的m RNA水平（P＜0.05）。进一步研究发现:大豆球蛋白加剧中肠和后肠的细胞凋亡的调控途径存在差异:在中肠,仅通过TNF-α介导的死亡受体途径以及Bcl-2、Bax和Apaf-1（不介导Mcl-1和IAP）介导的线粒体途径加剧细胞凋亡;而在后肠,则通过TNF-α和Fas L介导的死亡受体途径以及Bcl-2、Bax、Mcl-1、IAP和Apaf-1介导的线粒体途径加剧细胞凋亡。1.4大豆球蛋白对幼草鱼肠道紧密连接m RNA水平的影响本研究结果表明:大豆球蛋白显著下调了草鱼前肠claudin-c的m RNA水平,中肠ZO-1、ZO-2b、Occludin、claudin-7a、claudin-12以及后肠ZO-1、ZO-2b、Occludin、claudin-3c、claudin-7a、claudin-7b、claudin-11和claudin-12的m RNA水平（P＜0.05）,显著提高了草鱼中肠和后肠claudin-15a和claudin-15b的m RNA水平（P＜0.05）。以上结果表明:大豆球蛋白显著破坏了草鱼中肠和后肠的紧密连接。1.5谷氨酰胺对大豆球蛋白引起的肠道结构破坏有缓解作用同大豆球蛋白组相比,谷氨酰胺添加显著提高了幼草鱼摄食量、末重,日增重,特异生长率,饵料系数及饲料效率（P＜0.05）,同时显著降低了草鱼血清中的二胺氧化酶活性和D-乳酸含量（P＜0.05）。在中肠,谷氨酰胺添加显著降低了活性氧和氧化损伤产物的含量（P＜0.05）,降低了DNA片段化现象和凋亡酶活性（P＜0.05）,并上调了部分紧密连接蛋白的m RNA丰度;在后肠,谷氨酰胺添加提高了抗氧化酶GST的活性和GSH的含量（P＜0.05）。以上结果表明,谷氨酰胺缓解了由大豆球蛋白引起的草鱼生长抑制效应及其对中后肠结构的破坏效应。2.大豆球蛋白消化产物效应物的筛选动物生长试验表明:大豆球蛋白可造成草鱼结构完整性的破坏,且其破坏作用主要集中于中肠和后肠。大豆球蛋白对肠道结构完整性的破坏作用可能与其消化产物有关,因此,设计试验二,考察大豆球蛋白消化产物对草鱼肠上皮细胞结构完整性的影响以及筛选出消化产物的可能效应物,试验二分为三个小试验。2.1大豆球蛋白在草鱼体内外的消化试验试验2.1分为体内消化试验和体外消化试验两部分。体内消化试验设置两个处理:无氮日粮组（饲喂无氮日粮以排除消化酶和微生物等内源氮的影响）和大豆球蛋白组（饲喂大豆球蛋白作为唯一蛋白源的日粮）。体外消化试验提取大豆球蛋白处理组前、中、后肠的消化酶,模拟大豆球蛋白在体内的消化过程。体内消化试验结果发现:大豆球蛋白的酸性亚基几乎完全降解,而部分不被消化的产物始终存留在食糜和粪便中,包括了碱性亚基和新降解产生的6-15Kda的肽;体外消化结果与体内的消化试验结果一致。2.2不同时间大豆球蛋白的消化产物对草鱼肠道上皮细胞结构完整性的影响试验2.2将体外试验中大豆球蛋白不同消化时间的产物,包括0.5h、1h、2h、3h、4h和6h的消化产物,以及大豆球蛋白本身,分别设置2、4、6、8、10mg/m L的剂量处理组,对照组采取DMEM/F12基础处理基,对草鱼原代肠上皮细胞进行处理,每个处理6个重复,处理24h。结果发现:从8mg/m L及以上剂量的大豆球蛋白可显著提高草鱼肠道上皮细胞培养基中的乳酸脱氢酶（LDH）活性（P＜0.05）;0.5h、1h及2h的大豆球蛋白消化产物在8mg/m L及更高的剂量可显著提高草鱼肠道上皮细胞培养基LDH的活性（P＜0.05）,3h和4h的大豆球蛋白消化产物在6mg/m L及更高的剂量可显著提高草鱼肠道上皮细胞培养基LDH的活性（P＜0.05）,6h的大豆球蛋白消化产物在4mg/m L及更高的剂量可显著提高草鱼肠道上皮细胞培养基LDH的活性（P＜0.05）。同时,细胞中活性氧含量测定的结果也符合以上的趋势。以上结果表明:随着消化时间的增加,大豆球蛋白消化产物对草鱼肠道上皮细胞结构完整性的破坏作用逐渐增强。2.3大豆球蛋白消化6h的产物组分的分离及筛选为了更精准筛选出大豆球蛋白可能的效应消化产物,设计了试验2.3,将负面效应最为显著的6h消化产物进行分子筛分离,过Sephacryl S-100层析柱,将所得组分收集并纯化后进行细胞处理,分别设置1、2、3和4mg/m L的梯度,对照组为DMEM/F12处理基,对草鱼原代肠上皮细胞进行处理,每个处理6个重复,处理24h。结果发现:分子筛共分离出8个消化产物,按照分离峰的分离顺序,分别命名为DP1-DP8;其中,DP1在4mg/m L及更高的剂量可显著提高草鱼肠道上皮细胞培养基LDH的活性（P＜0.05）,DP4及DP6在3mg/m L及更高的剂量可显著提高草鱼肠道上皮细胞培养基LDH的活性（P＜0.05）,而DP3消化产物在1mg/m L及更高的剂量可显著提高肠道上皮细胞培养基LDH的活性（P＜0.05）,其它的消化产物对草鱼肠道上皮细胞培养基LDH的活性无显著影响（P≥0.05）。同时,细胞中活性氧含量测定的结果也符合以上的趋势。DP1大于200k Da,占比57.65%;DP3分子量为10k Da,占比21.46%;DP4和DP6分子量处于5-6k Da的区间,占比分别为2.69%和3.06%。以上结果表明,DP1,DP3,DP4,DP6可能是6h大豆球蛋白消化产物中导致草鱼肠道上皮细胞结构完整性破坏的效应物,其中DP3的负面作用最强。3.大豆球蛋白及其消化产物效应物对草鱼肠道上皮细胞氧化损伤的影响及机制研究试验二分离出了大豆球蛋白消化产物中的效应物,为进一步研究大豆球蛋白及其消化产物对草鱼肠道氧化损伤的影响及可能机制设计了试验三,分为4个小试验。3.1大豆球蛋白对草鱼肠道上皮细胞活性氧产生的影响及机制研究试验3.1主要考察大豆球蛋白对草鱼肠道上皮细胞活性氧产生的影响及机制,分为四个部分。首先考察大豆球蛋白对草鱼肠上皮细胞活性氧产生三个主要通路的影响,设置两个处理,分别为对照组和8mg/m L的大豆球蛋白处理组,每个处理6个重复,处理24h。结果发现,8mg/m L的大豆球蛋白可显著提高草鱼肠道上皮细胞NOX活性及线粒体ROS含量（P＜0.05）,但对肠道上皮细胞的XOD活性无显著影响（P≥0.05）。其次,为确定大豆球蛋白调控草鱼肠上皮细胞活性氧产生的主要通路,通过添加NOX抑制剂Apocynin和线粒体活性氧产生抑制剂Mitoq进行试验,共包括6个处理组:对照组、大豆球蛋白组（8mg/m L）、对照组+Apocynin、大豆球蛋白+Apocynin、对照组+Mitoq以及大豆球蛋白+Mitoq。结果发现,大豆球蛋白加Mitoq对NOX活性无显著影响（P≥0.05）;大豆球蛋白加Apocynin则可显著降低草鱼肠道上皮细胞NOX活性和线粒体活性氧含量（P＜0.05）。结果说明:大豆球蛋白促草鱼肠上皮细胞活性氧产生的首要途径为NOX途径,进而促进线粒体活性氧的产生。第三,NOX在草鱼肠道上皮细胞有NOX1、NOX2、NOX4和DUOX四个亚型存在,为进一步考察NOX亚型在大豆球蛋白介导的活性氧产生中的作用,设置两个处理,分别为对照组和8mg/m L的大豆球蛋白处理组,每个处理6个重复,处理24h。结果发现:大豆球蛋白可显著上调草鱼肠道上皮细胞的NOX2的蛋白及m RNA水平以及其配体的m RNA水平（P＜0.05）,但对其它亚型均无显著影响。结果说明NOX2可能是大豆球蛋白在细胞活性氧产生中主要介导的NOX亚型。第四,为确定NOX2是否在大豆球蛋白促草鱼肠上皮细胞活性氧产生中起着主导作用,采用si RNA沉默的手段以及添加其抑制剂NOX2ds-tat进行试验,共设计6个处理组:对照组、大豆球蛋白组（8mg/m L）、对照组+NOX2-si RNA、大豆球蛋白+NOX2-si RNA、对照组+NOX2ds-tat、大豆球蛋白+NOX2ds-tat。结果发现:大豆球蛋白加NOX2抑制剂或NOX2-si RNA均可显著降低草鱼肠道上皮细胞NOX活性和线粒体活性氧含量（P＜0.05）。以上结果表明:大豆球蛋白通过激活NOX2信号进而上调NOX活性和线粒体活性氧的产生,从而促进了草鱼肠道上皮细胞活性氧的产生。3.2大豆球蛋白消化产物DP3对草鱼肠道上皮细胞活性氧产生的影响及机制研究试验3.2主要考察大豆球蛋白消化产物效应物DP3对草鱼肠道上皮细胞活性氧产生的影响及机制,也进行了四个部分的试验,采用同试验3.1一致的研究思路。最终结果发现:消化产物DP3通过NOX1信号（而不是NOX2）进而上调NOX活性和线粒体活性氧的产生,从而促进草鱼肠道上皮细胞活性氧的产生。3.3大豆球蛋白对草鱼肠道上皮细胞活性氧清除能力的影响及机制研究试验3.1和3.2探究了大豆球蛋白对草鱼肠道上皮细胞活性氧产生的影响及机制,细胞活性氧含量的上升不仅与其产生有关,还与其清除能力有关。试验3.3旨在考察大豆球蛋白对草鱼肠道上皮细胞活性氧清除能力即抗氧化能力的影响及机制,共分为三个部分。首先考察了大豆球蛋白对草鱼肠道上皮细胞抗氧化能力的影响,共设计两个处理组:包括对照组和大豆球蛋白处理组（8mg/m L）。结果发现:大豆球蛋白可显著降低抗氧化酶的活性（P＜0.05）,显著下调了对应抗氧化酶的m RNA水平（P＜0.05）和细胞核内Nrf2的蛋白水平（P＜0.05）。结果表明:大豆球蛋白可降低草鱼肠上皮细胞的活性氧清除能力,与Nrf2信号的抑制有关。其次,Keap1是调控Nrf2的重要上游信号,在鱼类上Keap1有两种亚型,分别为Keap1a和Keap1b,为探究Keap1a-Nrf2信号在大豆球蛋白降低草鱼肠道上皮细胞抗氧化能力中的作用,通过si RNA的手段进行试验,共设计四个处理:对照组、大豆球蛋白组、对照+Keap1a-si RNA、大豆球蛋白+Keap1a-si RNA。结果发现:大豆球蛋白+Keap1asi RNA对草鱼肠道上皮细胞抗氧化酶活性和m RNA水平无显著影响（P≥0.05）,同时对细胞核内Nrf2的蛋白水平无显著影响（P≥0.05）。第三,为探究Keap1b在大豆球蛋白降低草鱼肠道上皮细胞抗氧化能力中的作用,通过si RNA的手段进行试验,共设计四个处理:对照组、大豆球蛋白组、对照+Keap1bsi RNA、大豆球蛋白+Keap1b-si RNA。结果发现:大豆球蛋白+Keap1b-si RNA显著升高了抗氧化酶的活性（P＜0.05）,同时显著上调了其m RNA水平（P＜0.05）,以及细胞核内的Nrf2蛋白水平（P＜0.05）。以上结果表明,大豆球蛋白通过Keap1b-Nrf2而不是Keap1a-Nrf2的信号抑制了草鱼肠道上皮细胞活性氧的清除能力。3.4大豆球蛋白消化产物DP3对草鱼肠道上皮细胞活性氧清除能力的影响及机制研究试验3.4旨在考察DP3对草鱼肠道上皮细胞抗氧化能力的影响及机制,试验也分为3个部分,采用同3.3一致的研究思路。最终结果表明:大豆球蛋白消化产物DP3通过Keap1a-Nrf2而不是Keap1b-Nrf2的信号抑制了草鱼肠道上皮细胞活性氧的清除能力。4.大豆球蛋白及其消化产物效应物对草鱼肠道上皮细胞凋亡的影响及其机制研究试验三已探究了大豆球蛋白及其消化产物对草鱼肠道上皮细胞氧化损伤的影响及机制,但细胞结构完整性还与细胞凋亡有关,为进一步研究大豆球蛋白及其消化产物对肠道上皮细胞凋亡的影响及机制设计了试验四,共分为两个试验。4.1大豆球蛋白对肠上皮细胞凋亡的影响及相关机制试验4.1共分为两个部分。首先考察大豆球蛋白对草鱼肠道上皮细胞凋亡的影响,设计2、4、6、8、10和12mg/m L的浓度梯度处理。结果发现:8mg/m L及之上浓度的大豆球蛋白处理可显著提高了草鱼肠道上皮细胞细胞的DNA片段化和caspase-3的活性;8mg/m L的大豆球蛋白对死亡受体途径凋亡的信号分子无显著影响;线粒体途径凋亡方面,8mg/m L的大豆球蛋白显著下调了Mcl-1、Bcl-2的m RNA水平,显著上调了Bax的m RNA水平,导致其线粒体的通透性增加（P＜0.05）,进而显著上调了线粒体释放出的细胞色素c蛋白水平和caspase-9的活性（P＜0.05）;MAPK信号方面,大豆球蛋白显著提高了P-p38-MAPK/T-p38-MAPK的比例（P＜0.05）,但是对P-JNK1/2/T-JNK1/2的比例无显著影响（P≥0.05）。表明:大豆球蛋白促进了草鱼肠上皮细胞的线粒体凋亡,可能是通过p38-MAPK信号介导。其次,为确定p38-MAPK在大豆球蛋白促草鱼肠上皮细胞凋亡中的作用,采用添加抑制剂的手段,共设计四个试验处理:对照组,大豆球蛋白组,对照+SB202190（p38-MAPK磷酸化抑制剂）,大豆球蛋白+SB202190。结果发现:大豆球蛋白+SB202190显著降低了草鱼肠上皮细胞DNA片段化,caspase-3和caspase-9的活性,线粒体通透性（P＜0.05）,以及细胞色素c从线粒体的释放量（P＜0.05）。以上结果表明:大豆球蛋白通过p38-MAPK通路促进了草鱼肠道上皮细胞的线粒体凋亡。4.2大豆球蛋白消化产物DP3对肠上皮细胞凋亡的影响及相关机制试验4.2共分为两个部分,采用同4.1一致思路的试验设计。最终结果表明:大豆球蛋白消化产物DP3通过JNK1/2通路而不是p38-MAPK通路促进了草鱼肠道上皮细胞的TNF-α死亡受体凋亡和线粒体凋亡。综上所述,大豆球蛋白可降低草鱼的生长性能,破坏草鱼肠道结构完整性,对肠道结构完整性的破坏主要与其对草鱼中、后肠导致的氧化损伤,细胞凋亡及破坏了细胞间的紧密连接密切相关;谷氨酰胺可缓解由大豆球蛋白引起的草鱼的生长抑制和肠道破坏作用;大豆球蛋白在草鱼肠道中随着其消化时间的增长,其对应的消化产物对草鱼肠道上皮细胞结构完整性的破坏作用越强,对6h大豆球蛋白消化产物进行分子筛分离后,共得到4种破坏草鱼肠道上皮细胞结构完整性的产物,其中DP3的负面作用最强;大豆球蛋白及其消化产物DP3均可造成草鱼肠道上皮细胞的活性氧含量上升和氧化损伤,大豆球蛋白主要通过NOX2途径促进草鱼肠道上皮细胞的活性氧产生,通过抑制Keap1b-Nrf2信号来抑制草鱼肠道上皮细胞的活性氧清除能力,而DP3主要通过NOX1途径（而不是NOX2途径）促进草鱼肠道上皮细胞的活性氧产生,通过抑制Keap1a-Nrf2信号（而不是Keap1b-Nrf2）来抑制草鱼肠道上皮细胞的活性氧清除能力;大豆球蛋白通过p38-MAPK信号而非JNK1/2信号途径促进草鱼肠道上皮细胞的线粒体凋亡,而对其死亡受体凋亡途径没有影响;而大豆球蛋白消化产物DP3主要通过JNK1/2信号而非p38-MAPK信号通路促进草鱼肠道上皮细胞的TNF-α死亡受体凋亡和线粒体凋亡。