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研究背景:疟疾仍然是全球重大传染病之一,尤其是恶性疟原虫,严重的危害人类健康。对于恶性疟原虫致病基因的研究仍需深入。真核生物中,肌动蛋白相关蛋白（Arps）家族是相对保守的,研究表明其成员是基因调控复合物的主要组成部分。恶性疟原虫中,生物信息学基因组分析预测有相似功能的Arp直系同源物,包括PfArp1,PfArp4和PfArp6。恶性疟原虫Arp4和Arp6生物学功能和对致病基因的调控机制尚未见到系统报道。目的:探明PfArp4和PfArp6蛋白调控的靶基因及其调控基因表达的作用机制。方法:1.基因编辑:从疟原虫基因组数据文库PlasmoDB（https://plasmodb.org/plasmo/）上下载PfArp4（PF3D71422800）和PfArp6（PF3D70719300）序列,用SnapGene软件进行设计,在CRISPR/Cas9技术原理的指导下,进行knock out（KO）,knock in（KI）和knock down（KD）编辑。构建质粒进行聚合酶链式反应（PCR）,其中包括修饰引物PCR技术,长片段PCR技术和复合PCR技术等。以恶性疟原虫3D7G7为模板,扩增设计的DNA序列,利用DNA连接酶将同源修饰DNA序列和sgRNA序列连接在Pl6质粒上。2.转基因虫株的验证和筛选:构建的质粒经测序验证正确后,与Cas9质粒混合后一起通过电转染法导入野生型3D7G7中,对恶性疟原虫Arp4和Arp6进行基因编辑修饰,并通过抗药基因进行药物筛选。通过药物筛选的转基因疟原虫,首先进行PCR验证修饰基因,然后western blot实验验证修饰后基因蛋白表达。最后进行克隆化获取单克隆转基因虫株。3.PfArp4和PfArp6基因不同时期蛋白表达情况和定位:分别收集恶性疟原虫R期、T期和S期的蛋白,用western blot实验鉴定不同时期PfArp4和PfArp6蛋白的表达情况。在不同浓度的GlcN药物下,对已插入Ty1-Ribo标签的转基因疟原虫进行蛋白表达下调实验,通过western blot实验鉴定蛋白的下调程度。并通过不同药物浓度GlcN作用,计数两个生活周期后晚期裂殖子数,观察转基因疟原虫生长状态。通过co-IFA实验鉴定PfArp4和PfArp6在恶性疟原虫细胞中的定位,以及两者之间的关系。并通过co-IP实验进一步观察PfArp4和PfArp6蛋白的相互作用。4.PfArp4和PfArp6基因RNA和DNA水平表达情况:利用RNA-seq实验观察PfArp4（+/-GlcN）的转录本表达。通过ChIP与第二代测序技术相结合,富集特异性结合PfArp4或PfArp6蛋白的DNA片段,并建立相应的基因文库,分析恶性疟原虫中Arp4和Arp6基因功能。结果:1.质粒构建和转基因虫株:构建出KO,KI和KD修饰的10个重组质粒。获得在PfArp4和PfArp6基因插入Ty1-HA和Ty1-Ribo标签,以及在PfArp4上插入Ty1标签和PfArp6上插入HA标签的转基因疟原虫。2.PfArp4和PfArp6的蛋白表达和恶性疟原虫的生长状态:恶性疟原虫Arp4和Arp6蛋白不同时期表达情况,PfArp4蛋白主要在R期表达,T/S期其次,而PfArp6在T/S期主要表达,R期其次表达。GlcN在5mmol的浓度下使插入Ty1-Ribo标签的转基因疟原虫的PfArp4和PfArp6蛋白表达下调,PfArp4在T期下调最为明显。PfArp4转基因疟原虫的第三个生长周期原虫率明显降低,但PfArp6转基因疟原虫未见明显改变。PfArp4转基因疟原虫在GlcN浓度为5mmol下,第二个生长周期的晚期的裂殖子数下降明显（P<0.0001）。3.恶性疟原虫中Arp4和Arp6基因定位:通过co-IFA实验发现PfArp4和PfArp6基因定位在恶性疟原虫细胞核上,并且两者有部分重合。并且co-IP实验发现通过PfArp6上的HA标签下来蛋白,拉下的蛋白中有Ty1标签的PfArp4蛋白,说明两者有相互作用。4.PfArp4和PfArp6基因RNA和DNA水平表达情况:RNA-seq实验发现在GlcN药物作用后PfArp4蛋白下调,广泛影响转录本表达。而ChIP-seq实验发现恶性疟原虫R期的PfArp4和PfArp6蛋白在60个var基因上均有富集,并且两种蛋白富集的位点相同。其中PfArp4在染色体着丝粒的侧翼位点上有明显富集。PfArp4蛋白下调导致H2A.Z和H3K9ac在基因起始密码子处富集改变,特别是在染色体着丝粒上的H2A.Z的富集。结论:1.成功获得PfArp4和PfArp6的KI和KD虫株,以及两者加入不同标签的双标记虫株,PfArp4和PfArp6蛋白定位于恶性疟原虫的细胞核上,两者部分重叠,实验表明两者互相作用;2.PfArp4的诱导下调导致恶性疟原虫的生长受限;3.PfArp4的诱导下调导致真核基因上游区域的H2A.Z和H3K9ac水平下降,从而抑制了H2A.Z依赖基因的表达;4.PfArp4作为着丝粒结构的边界,可能通过控制H2A.Z富集影响着丝粒功能。