论文部分内容阅读
前体mRNA的多聚腺苷酸化(Polyadenylation)是指当mRNA转录出来之后,由Poly(A)因子组成的多聚腺苷酸化机器在其3’端剪切位点进行切割,并由Poly(A)聚合酶添加Poly(A)尾巴形成成熟mRNA的过程。多聚腺苷酸化是植物基因表达调控的关键步骤和重要枢纽。多聚腺苷酸化机器是由一系列Poly(A)因子组装而成的,目前已经报道的Poly(A)因子有:剪切与多聚腺苷酸特异因子,偶对蛋白,剪切因子I,剪切刺激因子,剪切因子II,Poly(A)聚合酶,Poly(A)结合蛋白等。mRNA的多聚腺苷酸化机制,目前研究较多的是动物和真菌,参与剪切和加工的Poly(A)因子主要定位于细胞核和细胞质。而在高等植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)中,目前的报道仅见于细胞核。为系统性探究高等植物拟南芥Poly(A)因子的功能及亚细胞定位,本课题选取了43个拟南芥Poly(A)因子进行克隆和亚细胞定位研究。首先,我们对以上Poly(A)因子做了种内和种间序列比对及进化分析,结果显示,43个Poly(A)因子共聚为4支,At4g25550和At4g29820的亲缘关系最近,这可能是由于二者都是剪切因子,在细胞内也许具有相似的功能。Poly(A)因子在动植物之间比较保守,同时拟南芥Poly(A)因子也有一些特异序列,是动物中没有的,以期望在植物中有新的发现。接着我们成功克隆了其中32个拟南芥Poly(A)因子的编码基因,构建植物表达载体pCAMBIA3301-ACT2-Poly(A)因子并进行烟草(Nicotiana tabacum)转化,结果有15个Poly(A)因子转化成功,分别是CPSF73(AT1G61010),CstF64(AT1G71800),ESP1(AT1G73840),CFIm25(At4g25550、At4g29820),PCFS(At4g04885),CLPS(AT3G04680),PABN(At5g65260、At5g51120),PAP(At2g25850、At4g32850),Symplekin(AT1G27595、AT5G27590)和GLD-2 like(At2G45620、AT2G40520)。荧光显微镜观察发现:Poly(A)因子在烟草叶片下表皮细胞中成功获得表达;其中CFIm25与GLD-2 like(由At2G45620和AT2G40520编码)在细胞质和细胞核中均有表达,且主要在细胞质表达,提示该因子除了参与细胞核前体mRNA的加工外,在细胞质中也发挥一定的生物学功能。由AT5G27590编码的Symplekin只在细胞质有表达,一方面暗示该因子也许不是拟南芥前体mRNA加工所必需的蛋白,另一方面提示该因子可能在细胞质中发挥着更加重要的作用,这需要更深入的功能研究来证明。由AT1G61010编码的CPSF73(I),AT1G71800编码的CstF64,AT1G73840编码的ESP1,At4g04885编码的PCFS,AT3G04680编码的CLPS,At5g65260和At5g51120编码的PABN,At2g25850和At4g32850编码的PAP,以及AT1G27595编码的Symplekin,都只在细胞核有表达。通过花序浸泡法将重组载体转化到拟南芥中,结果有11个Poly(A)因子成功整合到部分植株的基因组中,分别是CPSF73(AT1G61010),ESP1(AT1G73840),CFIm25(At4g25550、At4g29820),PCFS(At4g04885),PABN(At5g51120),Symplekin(AT1G27595、AT1G27570)和GLD-2 like(AT3G56320、AT2G40520、AT2G39740)。同时,还观察到几株有早花表型的拟南芥植株,分别是PABN(At5g65260和At5g51120)、CFIm25(At4g25550)、PAP(At2g25850)、CPSF160(AT5G51660)和Symplekin(AT1G27595)。综上,本结果为进一步深入研究拟南芥Poly(A)因子的功能奠定了基础,有助于揭示高等植物的多聚腺苷酸化机理,同时为多聚腺苷酸化相关疾病的研究提供理论支撑。