目的:制作大乳鼠切牙牙胚的组织切片,显微镜下观察新出生的大乳鼠切牙牙胚发育情况,选择牙胚发育处于钟状期的乳鼠进行下一步实验。将钟状期大乳鼠切牙牙胚经酶消化后,体视显微镜下分离颈环上皮细胞并进行体外培养,观察颈环上皮细胞的形态,纯化后免疫组织化学染色法进行鉴定。本实验旨在建立牙齿上皮干细胞的分离和体外培养模式,以提供牙齿上皮干细胞的种子细胞来源,为牙齿上皮干细胞的移植奠定基础。方法:1.大乳鼠切牙牙胚组织切片的制作:选择新出生的大乳鼠,鼠龄分别为1天、2天和3天,断颈处死后,剪取下领骨,不行脱钙,直接按常规要求制备成石蜡包埋组织块,梯度酒精脱水,二甲苯透明,行HE染色后光学显微镜下观察。2.实验一:分离并培养大乳鼠切牙颈环上皮细胞:①取出生2天的大乳鼠,引颈处死,置75%酒精浸泡2-3秒钟,超净工作台内无菌条件下用眼科剪刀剪取下颌骨,尽量剔净下颌骨以外的组织,放入盛有含双抗的Hanks液培养皿中,洗净血液,转入另一盛有含双抗的Hanks液培养皿中,置体视显微镜下,小心用探针分离出下切牙牙胚。经酶消化后,用显微镊从牙胚中机械撕脱出牙囊和牙乳头,将成釉器用培养液冲洗,置于培养皿中体视显微镜下从成釉器中切取颈环组织。移至培养瓶内置于100%湿度,5%CO2,37℃的培养箱内孵育。②不同培养基培养颈环上皮细胞:将分离的颈环组织分别置于1640培养基和DMEM/F-12培养基中培养,观察颈环上皮细胞在两种不同培养基中的生长情况,探索较有利于颈环组织生长的基本条件。3.实验二:纯化培养的上皮细胞,并免疫组织化学方法鉴定:①颈环上皮细胞的纯化:待上述培养的细胞铺满培养皿底,加入消化液振荡消化,弃上清,加入培养基,分别移至Ⅳ型胶原包被的培养皿和未作处理的培养皿内。待细胞贴壁后,更换培养基,置37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱内培养,隔日换液。经3-5次换液,更换鼠Ⅳ型胶原包被的培养皿,并重复上述过程。观察Ⅳ型胶原包被的培养皿对细胞纯化的效果。②对纯化的原代细胞常规制备细胞爬片,一抗为兔抗鼠的β1整合素多克隆抗体和CK角蛋白单克隆抗体,用0.1ml/L的PBS液替代一抗作空白对照。免疫组织化学染色过程按检测试剂盒说明,分别以所培养细胞能否呈克隆状生长和β1整合素、角蛋白免疫细胞化学染色进行鉴定。结果:1.大乳鼠切牙牙胚组织切片制作:①出生1天大乳鼠切牙牙胚组织切片:可见幼稚的颈环结构,组织切片可见内釉上皮、外釉上皮和中间层细胞。颈环组织细胞的活力及增殖能力及代谢活动较幼稚。②出生2天大乳鼠切牙牙胚组织切片:可见清楚的颈环结构,组织切片可见内釉上皮、外釉上皮和中间层细胞。颈环组织细胞的活力及增殖能力均较强,代谢活动也十分旺盛。③出生3天大乳鼠切牙牙胚组织切片:可见清楚的颈环结构,组织切片可见内釉上皮、外釉上皮和中间层细胞。但出生3天大鼠的颈环上皮细胞较第2天的扁平。本试验选取出生2天大乳鼠切牙的牙胚作细胞培养。2.大乳鼠切牙颈环组织的分离和上皮细胞的培养:①大乳鼠切牙颈环组织的分离:从出生2天大乳鼠头部剪取下颌骨时,由于新生大乳鼠头部钙化未完全,较易剪取获得完整的下颌骨。置于体视显微镜下可以清楚地见到切牙牙胚,能够获得完整的下切牙牙胚。经消化处理后可以顺利地获得颈环组织。②大乳鼠切牙颈环上皮细胞的培养:DMEM/F-12培养基中培养:将获得的颈环组织培养24小时后,可观察到少量细胞游出组织块。原代培养细胞为混杂细胞,包括形态、排列明显不同的两种细胞:一种为纤维样的细胞,呈长梭形,细胞间较分散;另一种为上皮细胞,呈多角形,细胞连接紧密,呈克隆状生长。上皮细胞被成纤维样细胞包围,呈“岛”样分布。1640培养基培养:颈环细胞在1640培养基中生长的情况和DMEM/F-12培养基基本相同。但在细胞生长后期细胞的活力不及DMEM/F-12培养基好,这可能与培养基的组成有关。DMEM/F-12培养基较有利于颈环细胞的生长。3.细胞的纯化及免疫组织化学鉴定:①纯化切牙颈环上皮细胞:Ⅳ型胶原纯化:经2-3次更换Ⅳ型胶原包被的培养皿,纤维样细胞被完全除去,贴壁细胞全部是上皮细胞,体积较小较圆,胞浆丰富,胞核大,含2～3个核仁,长满后细胞密集排列为多角形,能够形成较大的克隆。未包被纯化:经2-3次更换培养皿,纤维样细胞未被完全除去,贴壁细胞部分是上皮细胞,体积较小较圆,胞浆丰富,胞核大,周围有少量的纤维细胞。②培养细胞的免疫组织化学鉴定:颈环上皮细胞抗角蛋白和β1多克隆抗体染色阳性,细胞胞浆内出现红色着色的阳性表达,空白对照组染色阴性。结论:1.出生2天的大乳鼠切牙牙胚组织切片,可见清楚的颈环结构,并可见内釉上皮、外釉上皮和中间层细胞。颈环组织细胞的活力及增殖能力均较强,代谢活动也十分旺盛;且出生2天大乳鼠切牙牙胚,未完全钙化,较容易获得,综合分析,选择出生2天大乳鼠切牙牙胚作为本实验的观察对象。2.细胞在两种不同培养基中的生长情况分析表明,在DMEM/F-12培养基中生长的细胞活力及生长状态较在1640培养基为好,这可能与DMEM/F-12培养基内含有利于细胞生长的营养物质有关。3.颈环上皮细胞在Ⅳ型胶原底物上贴壁数量多且生长良好,明显优于未包被的培养组,说明Ⅳ型胶原可以增加颈环上皮细胞的粘附。未作处理组细胞的增殖速度明显减缓,其原因可能是缺乏外在的细胞外基质,贴壁细胞少,可能与细胞密度依赖性抑制有关。4.纯化细胞的免疫组织化学鉴定结果表明,颈环上皮细胞抗角蛋白CK和β1多克隆抗体染色阳性,细胞胞浆内出现红色着色的阳性表达,空白对照组染色阴性。表明所培养的细胞是富含干细胞的颈环上皮细胞。