随着慢性病、传染病、肿瘤等的发病率不断提高,体外诊断行业面临的压力和市场需求在不断增长,尤其是正处于高速发展期的分子诊断市场。在目前的分子检测中,核酸分子诊断产品仍然占据着主流地位,其中有70%以上利用的是PCR技术——发展起步较早,技术壁垒相对较低,国产化程度更高。本研究将结合具体的课题项目,基于多重实时荧光定量qPCR方法,来探讨核酸诊断产品的研发及测评历程。第一章主要围绕“高尿酸血症与痛风的分子分型研究项目”,细述了痛风急性发作预警试剂盒的研发过程。在最终成型的试剂盒中,针对6个靶标基因(IL1B、P2RX7、CXCL8、TLR2、TLR4、NLRP3)和 2 个管家基因(ACTB、GAPDH)的PCR扩增效率E均在92%～98%之间,可检测的线性动态范围涵盖102～108拷贝,对应线性相关系数R2≥0.99,检测限均在10～100拷贝之间,并可在多重竞争反应的干扰下实现对目标的精准定量(即使浓度差异高达10000倍,高浓度竞争靶标所造成的低浓度目的靶标Ct值变化也未超过1.3)。其检测特异性经过4种细胞系的测试验证,而检测性能也在不同仪器、不同试剂批次间保持稳定。此外,成功组装的配套试剂盒(用于RNA提取及逆转录)在与同类产品的对比中也表现良好,可直接应用于检测流程。第二章侧重评估了团队在“宫颈癌筛查项目”中研发的CerviHPV高危HPV DNA检测试剂盒。在基于437例宫颈拭子标本的对比中,我们发现,CerviHPV与cobasHPV试剂盒具有高度可比性,二者对HPV16、HPV18、12HPV和所有14种HR-HPV类型的检测一致率分别为99.5%、100%、91.7%和92.2%,相应的kappa值分别为0.987、1.000、0.782和0.839。且在模拟实验中,CerviHPV能够比cobasHPV更均一地检测12HPV类型。而在另外93例宫颈拭子标本的对比实验中,CerviHPV与careHPV试剂盒的检测一致率达到91.4%,相应的kappa值为0.682,此外还鉴别出careHPV中1例确定的的假阳性结果及2例可能的假阳性结果,展现了 CerviHPV具有更高的特异性,以及在HPV16、HPV18基因分型方面的性能优势。