研究背景：臭氧(ozone, O3)作为一种古老而创新的治疗方法,因其令人难以置信的多功能性,越来越多地被世界各地的医学工作者所认同。目前臭氧在腰椎间盘突出症(LDH)、手术失败综合征(FBSS)、软组织损伤和关节痛等疾病的治疗中得到了广泛的应用。但是臭氧可以影响中枢神经系统(CNS)的功能,如降低认知反应能力、减少运动能力、诱发头痛、引起睡眠-觉醒周期紊乱、神经功能障碍、神经元退化变性和神经化学反应的发生等。在临床上也有硬膜外注射医用臭氧误入蛛网膜下腔对中枢神经系统产生严重毒性作用的个案报道。因此在临床应用中,臭氧对于脊髓神经元的神经毒性问题引起了越来越多的重视。近年的体外研究证实,医用臭氧对中枢神经系统有神经毒性作用,并呈浓度相关性。关于其机制的进一步研究结果显示,低浓度医用臭氧处理胎鼠离体脊髓神经元后,可使胎鼠脊髓神经元峰值钙电流向超极化方向移动、钙通道激活阈值降低。细胞内大多数的Ca2+存储在内质网,联系内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERS)诱发细胞凋亡的理论(细胞内钙离子浓度改变造成内质网钙稳态失衡,使内质网腔内未折叠蛋白、错误折叠蛋白增加,将激活相应的信号传导通路,诱发内质网应激,若机体受到持续严重的ERS时,ERS就会诱导细胞走向凋亡),我们推测,臭氧可能通过某种通路诱发内质网钙释放,引起细胞钙超载,诱发内质网应激,进一步诱导细胞走向凋亡。当细胞内外环境发生紊乱时,内质网腔内未折叠蛋白或错折叠蛋白蓄积,诱发ERS。哺乳动物细胞可通过ATF6和XBP1两个系统调控ERS来适应生存。当ERS水平较低时,可仅通过ATF6的蛋白水解激活作用来处理；当ERS水平极高时,大量未折叠蛋白或错误折叠蛋白蓄积于内质网内,形成严重压力,IRE1激活,可促使XBP1mRNA剪接并发生翻译框移位,翻译产生具有高转录活性的剪接型XBP1蛋白,其转位进入细胞核,与位于靶基因启动子区域的ERS反应元件结合,上调一系列与蛋白折叠、分泌相关的基因,增大内质网和细胞的体积与表面积,提高细胞处理蛋白的能力,之后通过一系列的反应来减轻内质网压力。在哺乳动物,XBP1是内质网应激反应下被特异激活的信号转导分子,有两种XBP1,剪切型XBP1和未剪切型XBP1,只有XBP1的剪切形式才能高效激活内质网应激反应。Thuerauf等报道体外培养心肌细胞低氧暴露16h后XBP1及GRP78表达上调,当用编码XBP1显性负相腺病毒重组体感染心肌细胞后,GRP78表达下调,同时细胞凋亡数目增加。此外,Yoshida发现细胞中转染XBP1转录系统后,在用ERS诱导剂衣霉素或毒胡萝卜素处理细胞未见凋亡,而没有转染XBP1转录系统的细胞凋亡率为60.2%,这说明XBP1作为细胞保护性信号的关键分子影响着细胞转归。基于我们课题组前期关于低浓度医用臭氧对胎鼠离体脊髓神经元钙通道的影响的研究和同行对钙超载与细胞凋亡关系的研究,本研究第一部分从内质网钙通道水平探讨臭氧引起内质网钙释放的机制,以及内质网钙释放和CaMKII/ MAPK信号通路、细胞凋亡的关系。第二部分为了研究XBP1对臭氧诱导脊髓神经元凋亡是否有保护作用,本研究通过腺病毒载体介导XBP1过表达,检测医用臭氧能否激活内质网应激,并探讨了XBP1在这一过程中是否发挥保护作用以及其可能机制。本研究从内质网钙释放角度及后续可能的级联反应探讨臭氧引起脊髓神经元神经毒性的可能机制和预防该臭氧毒性可行性措施,为将来临床上更安全有效的使用医用臭氧提供理论依据。第一部分内质网钙离子释放和CaMKII/MAPK信号通路在臭氧脊髓神经元神经毒性中的作用及其机制研究研究目的：本研究检测体外条件下臭氧对脊髓神经元是否具有神经毒性,以及神经毒性的原因是否与内质网钙离子释放和CaMKⅡ/MAPK信号通路有关,进一步从细胞凋亡角度来探讨臭氧引起脊髓神经元神经毒性的可能机制。研究方法：1.大鼠脊髓神经元的原代培养2.光学显微镜观察大鼠脊髓神经元细胞的形态,并进行MAP-2免疫荧光鉴定3.CCK8法检测不同浓度医用臭氧对脊髓神经元的毒性4.激光共聚焦显微镜检测臭氧对脊髓神经元内质网钙离子释放的影响用Fluo-3/AM预处理脊髓神经元,负载后在激光共聚焦显微镜下检测加入40μg/ml臭氧培养液后钙流峰值变化。5.激光共聚焦显微镜检测内质网IP3/RYR信号通路是否参与臭氧诱导的钙离子释放6. Western blotting法检测臭氧是否通过促进内质网钙离子释放进一步激活CaMKⅡ和MAPK信号通路◆ Western blotting法检测臭氧处理之后phospho-CaMKⅡ (p-CaMKⅡ)的表达;◆ Western blotting法检测臭氧处理是否引起CaMKⅡ的磷酸化,以及是否与内质网钙离子释放有关；◆ Western blotting法检测臭氧处理是否引起MAPK信号通路的表达情况的改变,以及是否与内质网钙离子释放有关。7.TUNEL法检测臭氧是否通过促进内质网钙离子释放、激活CaMKⅡ和MAPK信号通路诱导脊髓神经元凋亡研究结果：1.原代培养新生大鼠脊髓神经元细胞的生长情况倒置相差显微镜下脊髓神经元细胞核大,界限清晰,折光性强,光晕明显,有明显的立体感,生长状态良好。2.体外培养大鼠脊髓神经元鉴定大鼠脊髓神经元经MAP-2染色后,经细胞计数和统计分析所培养的神经元纯度为89.70±4.70%。3.医用臭氧剂量依赖性的导致脊髓神经元神经毒性通过CCK-8比色法测定不同浓度医用臭氧干预后脊髓神经元的存活率。0μtg/ml和30μg/ml03不影响脊髓细胞元的存活率,而40μg/ml至100μg/ml臭氧对脊髓神经元的神经毒性呈剂量依赖性,更高浓度的臭氧干预后脊髓神经元存活困难。4.臭氧促进脊髓神经元内质网钙离子释放与对照组相比,臭氧处理组加入臭氧培养液后,细胞内Ca2+显著升高(P<0.05)；EGTA(细胞外钙离子螫合剂)预处理联合臭氧处理组细胞内Ca2+也显著升高(P<0.05),均差异极显著(P<0.05)。BAPTA-AM(细胞内钙离子螯合剂)预处理联合臭氧处理组与对照组相比,细胞内Ca2+无明显升高。Trapsi处理细胞后,细胞内Ca2+瞬间显著升高,之后钙离子浓度趋于稳定,再用臭氧处理,细胞内Ca2+无显著变化。5.内质网IP3/RYR信号通路参与臭氧诱导的钙离子释放2APB或者Dantrolin单独处理脊髓神经元,细胞内钙离子浓度无变化；2APB或者Dantrolin预处理细胞后,加入臭氧培养液,细胞内钙离子浓度也无变化；臭氧单独处理脊髓神经元细胞内Ca2+显著升高,与2APB或者Dantrolin单独处理相比,差异极显著(P<0.05),与2APB或者Dantrolin联合臭氧处理相比,差异极显著(P<0.05)。6.臭氧通过促进内质网钙离子释放进一步激活CaMKII/MAPK信号通路臭氧作用于脊髓神经元60min后,明显增加了p38和JNK信号通路的表达水平,而ERK1/2的表达水平无明显变化。进一步结果显示,臭氧激活p38和JNK信号通路的表达的作用能够被BAPTA/AM,KN62,2APB或者Dantrolene阻断。CaMKⅡ的磷酸化与p38和JNK信号通路的表达趋势一致。7.臭氧通过促进内质网钙离子释放、激活CaMKⅡ信号通路诱导脊髓神经元凋亡臭氧作用于脊髓神经元后24小时,凋亡细胞的数量明显增加。而且,臭氧诱导细胞凋亡的作用能够被BAPTA/AM或者KN62预处理阻断。BAPTA/AM或者KN62单独处理不会诱导细胞凋亡。结论：1.医用臭氧对脊髓神经元有神经毒性作用,且呈剂量依赖性。2.医用臭氧具有神经毒性,这一过程通过激活内质网钙离子释放和CaMKⅡ/ MAPK信号通路来实现。第二部分X-盒结合蛋白1(X-box binding proteinl,XBP1)在臭氧神经毒性保护机制中的作用研究研究目的：1.检测臭氧处理脊髓神经元后能否诱导内质网应激；2.检测XBP1在臭氧神经毒性过程中是否有保护作用及保护的可能机制。研究方法：1.重组腺病毒Adv-XBP1的构建和转染2.重组腺病毒Adv-XBP1对脊髓神经元XBP1过表达情况的鉴定RT-PCR和Western blotting法检测重组腺病毒Adv-XBP1处理脊髓神经元后内XBP1mRNA水平和蛋白水平表达的变化。3.观察臭氧处理之后内质网应激情况和XBP1的表达Western blotting法检测臭氧作用后脊髓神经元内GRP、CHOP和XBP1蛋白水平表达的变化,确定臭氧对内质网应激和XBP1通路的激活作用。4.观察XBP1重组腺病毒是否通过减少内质网应激保护臭氧诱导的细胞凋亡Western blotting法检测XBP1重组腺病毒预处理之后臭氧对脊髓神经元内GRP、CHOP和XBP1蛋白水平表达的影响,确定XBP1重组腺病毒对臭氧毒性的保护作用。研究结果：1.过表达腺病毒载体对脊髓神经元转染效率的鉴定脊髓神经元培养至7-8天,用不同滴度和不同持续时间的过表达腺病毒转染,观察转染后荧光强度的变化发现,最佳的转染时间为24h,最佳的转染滴度为80,该条件下转染效率达到80%。2.过表达腺病毒载体对脊髓神经元XBP1过表达效率的鉴定Adv-XBP1过表达腺病毒转染脊髓神经元之后,XBP1mRNA和相关蛋白的表达明显增加,而Adv-LacZ转染之后XBP1表达和对照组比较无统计学意义。3.臭氧暴露能够激活内质网应激和XBP1的剪切脊髓神经元臭氧处理之后,GRP78和CHOP蛋白的表达明显增加。此外,实时定量PCR检测结果显示,医用臭氧处理脊髓神经元之后能够增加XBP1mRNA的剪切,这种剪切与公认的内置网应激诱导Tunicamycin诱导的内质网应激相比,无统计学意义。另外,Western Blot结果显示臭氧能够明显增加XBP1蛋白的表达。4.过表达腺病毒对臭氧诱导内质网应激和脊髓神经元凋亡有保护作用臭氧处理之后GRP78和CHOP蛋白的表达明显增加,但用Adv-XBP1过表达腺病毒预处理之后再用臭氧处理,GRP78和CHOP蛋白的表达较单纯臭氧处理组明显降低。Adv-XBP1过表达腺病毒预处理联合臭氧处理脊髓神经元与Adv-LacZ腺病毒预处理联合臭氧处理相比,脊髓神经元的细胞活性增加,有统计学意义(P<0.05)。结论：1.医用臭氧作用于脊髓神经元能够激活内质网应激,增加XBP1的表达。2.XBP1重组腺病毒能够通过增加XBP1的表达,反馈抑制内质网应激,减缓细胞凋亡。