当内脏发生疾病时,体表相应部位出现皮下结节、牵涉痛、皮疹等病理反应的临床报道很多,这些病理反应常常伴随着疾病的发生而出现,并随着疾病的自愈而消退。这种内脏疾病能反应到体表的现象,中医远在两千年前早已发现,《素问·藏气法时论》记载：“心痛者,胸中痛,胁支满、膺背肩甲间痛,两臂内痛。”从此描述说明中国古代医生早已发现心痛可以反应到肩甲、两臂内侧等处,这不仅与临床上冠心病牵涉痛常出现的部位相一致,也正是十二经脉中心经经脉循行所过之处。因此,也有学者认为中医的经脉-脏腑相关理论是世界上最早的躯体-内脏相关学说。基于中医经脉-脏腑相关理论和西医的躯体-内脏相关学说,近年有学者提出腧穴面积的大小和功能的强弱会随着内脏功能的变化而发生改变的动态概念,并将这一规律称为腧穴的敏化。敏化腧穴不仅是一种新型的内脏疾病在体表的病理反应点,还是针灸治疗内脏疾病的最佳刺激点,当内脏发生疾病时,体表沉寂的腧穴可以被激活,其功能变得敏感而活跃,对相应内脏调节功能的“质”或“量”也会发生相应的变化。针灸可以治疗内脏疾病,缓解内脏疼痛,其疗效与电针强度、取穴部位密切相关。有关针刺镇痛的研究发现在同神经节段腧穴,针刺只要激活穴位深部的A类纤维就有明显的镇痛效应,而在异神经节段腧穴,针刺须激活穴位深部的C类纤维才能发挥镇痛效应。其机制可能与激活了脊髓和脊髓上中枢不同的内源性镇痛系统有关。虽然针刺镇痛的临床和实验研究很多,但是同时将痛源部位、体表敏化腧穴、电针强度综合起来考虑的研究甚少,关于体表敏化腧穴不同强度电针刺激缓解内脏痛的量效关系研究还是空白。本研究将具有躯体-内脏感觉会聚功能的脊髓背角广动力型(Wide Dynamic Range, WDR)神经元和延髓背侧网状核(Subnucleus Reticularis Dorsalis, SRD)全身异觉异位会聚神经元活动作为研究对象,观察生理和病理状态下这两类会聚神经元对不同强度电针传入的量-效激活反应,以及不同强度电针传入与内脏伤害性传入在这两类神经元的相互作用,来探讨腧穴敏化的规律和机制、电针镇痛的量效关系,以期阐明电针治疗内脏痛的最佳刺激部位和刺激强度,为临床提高电针镇痛效应提供参考。1材料和方法实验选用健康成年SD大鼠,体重250-300g,用10%的乌拉坦(urethane,1.0-1.2g-kg)腹腔注射麻醉,玻璃微电极细胞外记录神经元放电。所有记录到的神经元都用刷毛法观察其外周感受野在体表的分布范围,分别检验其体表感受野对各种机械刺激(包括触摸、电针齿镊夹皮)的反应和直结肠扩张刺激引起的反应,鉴定神经元的性质。在脊髓背角,凡是能够对来自体表感受野的各种机械刺激和来自内脏的扩张刺激均起激活反应的神经元,就被确定为WDR神经元；在延髓,凡是具有全身性的感受野,并且只能特异性地被体表和内脏的伤害性刺激激活,而对非伤害性刺激不发生反应的神经元就被确定为SRD神经元。内脏伤害性刺激采用直结肠扩张法,将一长约5-6cm的气囊经肛门插入直结肠,插入的深度约为4cm。内脏伤害性刺激由插入直结肠内的气囊充气超过20-50s实现。实验过程中直结肠扩张压力控制在60-80mmHg之间(40mmHg为伤害性刺激),两次重复的CRD刺激应至少间隔4min。分别在大鼠L2-4节段脊髓背角和延髓背侧网状亚核进行单细胞记录。观察内容分两部分：(1)观察WDR和SRD神经元在伤害性CRD刺激稳定激活的基础上,同时给予不同强度电针刺激对CRD引起的神经元痛敏反应的影响,探讨电针镇痛的量效关系；(2)观察在持续1min的伤害性CRD刺激前后,这两类神经元对来自感受野单纯电针刺激的量-效激活反应的变化,探讨腧穴敏化的规律及其机制。2结果2.1脊髓水平的实验结果于93只SD大鼠脊髓背角的L2-4节段共记录到168个神经元。其中广动力型(wide dynamic range neuron, WDR)神经元118个。大部分WDR神经元位于脊髓板层的第IV和V层,其外周感受野主要分布于记录部位同侧下半部皮肤,如：尾巴、下肢、会阴和臀部。在12个WDR神经元观察到60mmHg CRD刺激引起的神经元放电活动的激活率为100.90±21.41%,和背景活动相比有非常显著的差异(P<0.001),表明WDR神经元对来自同节段的内脏伤害性传入有稳定的激活反应。在60mmHg CRD刺激引起WDR神经元稳定激活的基础上,我们在体表非感受野分别观察了同神经节段穴区(选择位于记录部位对侧“足三里”穴区为中心)和异神经节段穴区(选择位于记录部位对侧“内关”穴区为中心)不同强度(1mA、2mA、4mA、6mA、8mA)电针刺激对CRD引起的神经元激活反应的影响。在同神经节段,电针能有效抑制CRD引起的WDR神经元的激活反应,和单纯CRD刺激引起的WDR神经元的激活反应相比,其抑制率分另为：11.43±3.40%(1mA)(P<0.05)、25.56±2.69%(2mA)(P<0.001)、46.35±3.44%(4mA)(P<0.001)、49.96±3.08%(6mA)(P<0.001)、47.04±4.79%(8mA)(P<0.001)。而在异神经节段,1mA电针刺激对CRD引起的WDR神经元的激活反应没有产生明显影响,与单纯CRD刺激时神经元的反应相比没有统计学差异(P>0.05)；当电针强度达到2mA时,我们开始观察到电针对CRD引起的WDR神经元的激活反应的抑制效应。从2-8mA,其抑制率分别为：19.70±6.61%(2mA)(P<0.05)、33.71±3.93%(4mA)(P<0.001)、40.25±4.71%(6mA)(P<0.001)、40.44±5.68%(8mA)(P<0.001)。表明当电针强度为1mA时,只能引起节段性的抑制效应；而当电针强度达到2mA时,能引起广泛性的抑制效应；当电针强度达到4-6mA时,这种抑制效应还会到达一个平台期。之后,我们观察了体表感受野穴区(选择位于记录部位同侧的“足三里”穴区为中心)不同强度电针传入与内脏伤害性传入在WDR神经元的相互作用。首先观察单纯电针刺激对WDR神经元的量-效激活反应,和神经元背景活动相比,单纯电针刺激引起的WDR神经元的激活率分别为：14.50±4.63%(1mA)(P<0.05)、40.09±6.27%(2mA)(P<0.001)、99.47±13.18%(4mA)(P<0.001)、156.62±20.50%(6mA)(P<0.001)、189.15±11.33%(8mA)(P<0.001)。可见,从1mA-8mA的范围内,WDR神经元对单纯电针刺激的激活反应呈明显的量-效线性递增关系。然后在ERD引起WDR神经元稳定激活的基础上,同时给予电针刺激,当电针刺激强度为1mA时,电针对CRD引起的WDR神经元激活反应无明显影响(P>0.05)。当电针强度为2mA时,电针可以使WDR神经元的激活反应进一步增强,神经元的反应从单纯CRD激活的基础上依次再激活43.46±5.97%(2mA)(P<0.001)、77.44±8.32%(4mA)(P<0.001)、85.29±7.08%(6mA)(P<0.001)、90.38±13.01%(8mA)(P<0.01)。可见,同时给予CRD和感受野电针两种刺激,WDR神经元在电针强度达到6mA时,其激活反应也接近平台期。这些结果还表明来自感受野穴位的电针传入和来自内脏的伤害性传入可以在脊髓背角WDR神经元产生易化的相互作用。基于以上实验结果,为了探讨腧穴敏化的脊髓机制,我们给予大鼠70-80mmHg CRD刺激持续lmin造成内脏伤害性损伤后,观察WDR神经元对感受野穴位单纯电针刺激的激活反应的变化。实验观察到在CRD刺激后WDR神经元对电针的激活反应明显增强。CRD刺激前,电针引起的WDR神经元放电活动的激活率分别为：18.19±7.49%(1mA)、105.39±17.21%(4mA)、175.81±20.16%(7mA)、200.14±23.49%(10mA)；而CRD刺激后,电针引起的WDR神经元放电活动的激活率分别为：95.09±26.37%(1mA)、202.44±18.90%(4mA)、278.41±32.64%(7mA)、280.84±39.87%(10mA)。并且在CRD刺激后,当电针强度达到7mA时,WDR神经元对电针的反应也接近平台期。表明持续的伤害性内脏传入可以易化脊髓背角WDR神经元,使其对来自体表感受野穴位的电针传入产生更强烈的反应。2.2延髓水平的实验结果于49只SD大鼠的延髓背角共记录到68个延髓背侧网状亚核(Subnucleus Reticularis Dorsalis,SRD)神经元。在16个SRD神经元系统观察了分级的CRD刺激引起的反应,在20-80mmHg的范围内,随着内脏扩张压力的升高,神经元反应的强度也随之增加,呈现出明显的量-效线性关系。表明SRD神经元对伤害性强度的内脏扩张刺激能做出准确的应答反应。由于这类神经元具有全身性的感受野,在60mmHg CRD刺激引起SRD神经元稳定激活的基础上,我们观察了与直结肠同神经节段的“足三里”穴区(取对侧)不同强度(1mA、2mA、4mA、6mA、8mA)电针刺激对CRD引起的SRD神经元激活反应的影响。实验观察到1mA电针刺激对CRD引起的SRD神经元的激活反应没有明显影响,电针后神经元的反应和单纯CRD刺激效应相比没有统计学差异(P>0.05)；2mA电针刺激对CRD引起的SRD神经元的激活反应有一定的抑制作用,其抑制率为19.43±3.28%(P<0.01)、4mA、6mA、8mA电针刺激引起的抑制率分别为31.87±3.92%(P<0.001)、51.78±5.13%(P<0.001)、55.70±7.82%(P<0.01)。可见,随着电针强度的增加,电针的抑制效应逐渐增强,但是当电针强度达到6mA时,这种抑制效应也接近平台期。为了探讨腧穴敏化的延髓机制,这部分实验同样给予大鼠70-80mmHg CRD刺激持续1min造成内脏伤害性损伤后,观察电针“足三里”穴区对SRD神经元激活阈值和强度的变化,实验选择1.5mA和6mA分别代表低于和高于C类纤维阈值的的电针强度。结果显示在CRD刺激前,1.5mA电针刺激对SRD神经元的放电活动没有任何影响,与背景活动相比没有统计学差异(P>0.05)；而在CRD刺激后,1.5mA电针刺激能明显激活SRD神经元,神经元的活动从背景活动的3.05±0.20spikes/s增加到4.81±0.46spikes-s,与背景活动相比,有非常显著的差异(P<O.001)当电针强度达到6mA时,CRD刺激前后电针对SRD神经元均有明显的激活作用。CRD刺激前后,电针引起的SRD神经元的激活率分别为318.34±53.56%、381.04±59.68%,CRD刺激前后的电针效应进行比较有显著的差异(P<0.01)。表明给予大鼠伤害性内脏扩张损伤后也可以易化延髓SRD神经元。3结论本研究系统分析了体表不同强度电针传入和内脏伤害性传入在脊髓背角WDR神经元和延髓背角SRD神经元的相互作用,得出以下结论：电针可以在脊髓和延髓抑制内脏伤害性反应,但是只有当电针达到一定的刺激强度时,电针的抑制效应才最明显,但并不是电针刺激强度越大,电针的抑制效应越明显。根据我们的实验结果,在脊髓水平,同节段穴区电针刺激强度在4-6mA时、异节段穴区电针刺激强度在6mA时,就能取得良好的抑制效应；而在延髓水平,电针强度在6mA时也能取得良好的抑制效应。从抑制强度来看,同节段穴区抑制强度最好,异节段穴区抑制强度稍低。在脊髓和延髓两个水平,伤害性内脏传入还可以易化相应节段体表的电针传入反应,引起体表相应穴区功能敏化。其发生机制与解释牵涉性痛觉过敏的会聚易化理论相一致。