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环氧化酶-2 (cyclooxygenase-2 ,COX-2)是分解花生四烯酸、生成各种内源性前列腺素(PG)过程中重要的诱生型限速酶,大量证据表明COX-2与多种肿瘤尤其是消化道肿瘤的发生、发展有密切关系。深入研究发现,COX-2能通过多种途径参与肿瘤的演进包括侵袭与转移这一重要过程。研究COX-2在肿瘤侵袭与转移过程中的作用及起效的机制对临床防治肿瘤有重要意义,COX-2有可能成为肿瘤治疗的一个新靶点。为此,我们首先通过基因重组技术构建反义COX-2基因真核表达载体,并采用脂质体法将其导入SGC-7901细胞,观察转染后的SGC-7901细胞侵袭力的变化,同时检测转染后细胞中血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮生长因子C(VEGF-C)和基质金属蛋白酶-2(MMP-2)的表达情况,探讨COX-2在肿瘤侵袭与转移中的作用和可能的起效机制。在此基础上,我们进一步观察了反义COX-2和COX-2抑制剂对胃癌细胞生物学行为的影响,以探讨COX-2作为一个新的靶点用于防治胃癌侵袭与转移的应用前景。目的1.利用DNA重组技术构建和鉴定反义COX-2真核表达载体2.探讨COX-2在胃癌细胞侵袭与转移过程中的作用及其机制3.观察反义COX-2对人胃癌细胞株SGC-7901生物学行为的影响,探讨其用于防治胃癌侵袭与转移的潜在价值方法与结果1.采用免疫组织化学方法检测胃癌组织中COX-2的表达,结果发现胃癌组织中COX-2蛋白的表达水平高于正常胃粘膜,胃癌组织中COX-2蛋白表达与患者年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤部位及肿瘤的组织学类型无关,与病变的浸润深度、淋巴结转移及远处转移有关,与胃癌的侵袭性相关。2.利用基因重组技术构建了反义COX-2真核表达载体,并经酶切和DNA测序鉴定。结果发现反义重组质粒经PstⅠ酶切鉴定后形成1.5kb和5.6kb的条带,与理论设计符合,DNA测序证明COX2反向插入载体对应位点,说明反义COX-2真核表达载体构建成功。3.采用脂质体法将反义重组质粒和空载体导入SGC-7901细胞,筛选转染子,并采用PCR技术扩增外源性NEO R基因进一步鉴定转染的正确性。结果发现在转染子均检测到有外源性NEO R基因存在,说明转染正确。4.观察了稳定表达反义COX-2基因的SGC-7901细胞内COX-2的表达情况,结果发现其表达下调,说明反义COX-2能有效抑制COX-2表达。5.观察了观察了稳定表达反义COX-2基因的SGC-7901细胞侵袭运动能力的变化,发现其侵袭和运动能力减弱。6.观察了稳定表达反义COX-2基因的SGC-7901细胞VEGF、VEGF-C、MMP-2表达的变化,结果发现三者表达下降。7.通过裸鼠移植瘤模型观察了稳定表达反义COX-2基因的SGC-7901细胞生物学行为的变化和COX-2特异性抑制剂SC-236对移植瘤生长的影响。结果发现反义COX-2能逆转SGC-7901细胞的恶性表型,COX-2特异性抑制剂SC-236能有效抑制移植瘤的生长。结论1.采用DNA重组技术成功构建了反义COX-2真核表达载体,将其转染人胃癌SGC-7901细胞株后得到稳定表达反义COX-2基因的SGC-7901细胞。2.稳定表达反义COX-2基因的SGC-7901细胞生长受到抑制,体外侵袭能力下降,说明COX-2对肿瘤细胞的生长及侵袭能力有促进作用。3.稳定表达反义COX-2基因的SGC-7901细胞中VEGF、VEGF-C和MMP-2的表达下降,说明COX-2对肿瘤细胞的生长及侵袭能力的促进作用有可能是通过促进VEGF、VEGF-C和MMP-2的表达来实现的。4.由稳定表达反义COX-2基因的SGC-7901细胞建立的裸鼠移植瘤的生长受到明显抑制。COX-2抑制剂SC236也能明显抑制SGC-7901细胞建立的裸鼠移植瘤的生长。说明SC236抑制肿瘤生长的作用是通过COX-2途径来起效的。5.稳定表达反义COX-2基因的SGC-7901细胞建立的裸鼠移植瘤中VEGF、VEGF-C、MMP-2的mRNA和蛋白水平下降,说明反义COX-2基因能有效减低肿瘤细胞的侵袭与转移能力。6.COX-2抑制剂等以COX-2为靶点来防治肿瘤侵袭与转移可能具有重要的潜在应用价值。