研究背景:化疗药物的应用使得各种肿瘤和免疫性疾病治愈率得到提高的同时,所带来的并发症越来越多地得到临床医师的重视。在女性生殖系统中,卵巢对化疗药物最敏感,长期大剂量的化疗会破坏卵巢组织,引起卵巢功能障碍,使得女性患者出现卵巢早衰（Premature overy failure POF）的改变,临床上主要表现为闭经、不孕、更年期综合征和老龄性疾病的提早发生,严重影响年轻妇女的生活质量和自信心。因此,如何在使用化疗药物的同时,保存妇女的卵巢功能及生殖功能是临床上值得深入研究的重要课题,有着巨大的医学需求。目前许多国内外学者已做了大量的研究,目的是寻找一种安全有效的方法,使化疗药物的卵巢损伤降到最低,主要研究方向集中在促性腺激素释放激素类似物（Gonadotropin-releasing-Hormone analogues GnRHa）的应用和组织冷冻保存-自体移植（CryoPreservation- autotransPlantation）方面。组织冷冻保存-自体移植存在技术性、安全性、甚至伦理性问题需要进一步解决,适用范畴较为局限,目前尚无发临床推广应用,因此GnRHa成为当前的研究热点。将GnRHa预防性应用于化疗前,通过抑制垂体FSH/LH的分泌,进一步抑制卵巢中小卵泡的有丝分裂,保留大部分原始卵泡,从而增强卵巢储备,化疗周期结束后且停用GnRHa,原始卵泡能够继续发育成熟为各级卵泡。如果通过大量的实验或临床统计证实GnRHa能够保护化疗中的卵巢,那么化疗药物损伤的问题就可能得到解决。促性腺激素释放激素（Gonadotropin-releasing-Hormone GnRH）是由下丘脑合成和分泌的,通过诱导垂体FSH/LH的分泌,并进一步诱导卵巢中各级卵泡的生长发育及排卵。GnRHa由通过替代GnRH结构的不同位点产生,包括GnRH激动剂和GnRH拮抗剂。既往试验多采用激动剂作为研究对象,临床应用后,结果存在较大争议,可能与其不能完全抑制女性下丘脑-垂体-卵巢轴（Hypothalamic-pituitary-ovarian axis HPOA）,起效时间较晚,需2-3周,结果导致化疗方案延迟;并且存在点火作用,导致血清性激素水平一过性升高,在此阶段的卵巢易受化疗药物的损伤。促性腺激素释放激素拮抗剂（Gonadotropin releasing Hormone Antagonist,GnRH拮抗剂,GnRHant）,对HPOA有较强且完整的抑制作用,并且副作用、用药剂量及时间均小于GnRH激动剂,表现为在数小时内即出现促性腺激素的释放减少,且不存在点火效应,是理想的GnRHa。本实验旨在探讨GnRH拮抗剂预防性应用对化疗后卵巢组织结构、卵巢内分泌功能、各级卵泡数量、卵子受精、胚胎发育、离体颗粒细胞结构及内分泌功能所起的一系列作用及机制,为临床肿瘤治疗和免疫性疾病中应用大剂量的化疗药物前采用GnRH拮抗剂保护卵巢功能提供一定的理论依据。研究目的与意义:1通过探讨单独化疗及GnRH拮抗剂联合化疗对大鼠卵巢储备能力的影响,为GnRH拮抗剂的临床应用提供理论依据;2通过探讨GnRH拮抗剂联合化疗对大鼠生殖功能及子代胎鼠生长发育的影响,揭示GnRH拮抗剂对化疗患者远期生活质量的影响;3探讨GnRH拮抗剂对化疗损伤性卵巢功能早衰的预防作用与卵巢颗粒细胞线粒体介导的凋亡途径的相关性,阐明GnRH拮抗剂可能的保护机制;4探讨GnRH拮抗剂对离体培养的人黄素化颗粒细胞结构与分泌功能的影响,阐明排除下丘脑-垂体的影响后,GnRH拮抗剂在卵巢局部水平所发挥的直接作用。研究方法:1.构建和评价化疗损伤性POF动物模型SD性成熟雌性大鼠,腹腔注射不同浓度（10mg/kg,20mg/kg,30mg/kg）环磷酰胺（Cytoxan CTX）20天。用药结束后,称取大鼠体重,卵巢及子宫湿重;通过阴道脱落细胞涂片法检测大鼠动情周期（Estrous cycle ESC）变化;摘大鼠眼球取血,酶联免疫吸附测定（Enzyme-linkedimmunosorbant assay ELISA ）各组大鼠血清雌二醇（ Estradiol E2 ）、血清促卵泡素（Follicle-stimulating hormone FSH）水平;卵巢组织HE染色,镜下观察卵巢组织结构并计数各级卵泡数、总卵泡数;对重要脏器:心脏、肝脏、肾脏、肺脏HE染色,进行病理学检验。2.分析西曲瑞克（第三代GnRH拮抗剂）的剂量-效应关系SD性成熟雌性大鼠,腹腔注射不同浓度（1μg/d,3μg/d,5μg/d）西曲瑞克（Cetrorelix）10天,通过阴道脱落细胞涂片法检测大鼠动情周期变化;停药0天后摘眼球取血,ELISA法检测各组血清FSH、血清黄体生成素（Luteinizing hormone LH）水平;停药第5天和第10天,分别摘眼球取血两次,ELISA法检测各组大鼠血清FSH、LH水平。3.西曲瑞克对化疗大鼠卵巢功能的影响SD性成熟雌性大鼠,连续腹腔注射5μg/d西曲瑞克10天后,西曲瑞克5μg/d和CTX20mg/（kg·d）同时腹腔注射,连续20d。停药0天和停药10天后分批处死50%的大鼠,各称取体重,卵巢、子宫湿重;通过阴道脱落细胞涂片法检测大鼠动情周期;大鼠摘眼球取血,ELISA法检测各组大鼠血清E2、FSH水平;HE染色,镜下计数各级卵泡数和卵泡总数;对卵巢组织进行病理学检测。4.检测西曲瑞克对化疗大鼠生殖功能及子代胎鼠生长发育的影响SD性成熟雌性大鼠,腹腔注射5μg/d西曲瑞克10天后,西曲瑞克5μg/d和CTX20mg/（kg·d）同时腹腔注射,连续20天。停药10天后,按雌、雄大鼠按照2:1比例合笼交配,第二日清晨作阴道精子涂片检测以发现阴栓和查到精子为受孕标志,为“受孕日”,用GD（Gestation day）表示。记录各组孕鼠GD₁₀、GD₁₂、GD₁₄、GD₁₇、GD₂₀体重变化,孕鼠于GD₂₀脱颈处死,剖腹检查妊娠结果;记录子宫着床数,镜下计数双侧卵巢黄体数,总胎仔数,活胎数,吸收胎及死胎数;计算大鼠交配率,妊娠率,吸收胎率,死胎率;各组活胎鼠逐一记录胎仔体重、体长、尾长,性别比（雄性%）;检查胎鼠外观有无异常,Bouins液固定后检查胎鼠内脏有无畸形及缺失,茜素红透明骨骼染色检测胎鼠骨骼有无畸形及缺失。5.检测GnRH拮抗剂对化疗损伤性POF的预防作用与卵巢颗粒细胞线粒体凋亡途径的相关性透射电镜技术检测不同药物处理后各组大鼠卵巢颗粒细胞超微形态结构;利用荧光探针JC-1染色颗粒细胞细胞线粒体膜,激光共聚焦显微镜检测颗粒细胞线粒体膜电位变化;原位末端标记技术（TUNEL）测定卵巢颗粒细胞凋亡情况,计算凋亡指数（Apoptotic index AI）;免疫印记（Westernblotting）方法检测细胞色素C（Cytochrome C Cyt-C）在卵巢组织线粒体及胞质空间分布情况及SP免疫组织化学方法检测Cyt-C在卵巢颗粒胞浆的表达;同时SP免疫组化方法进行颗粒细胞调亡指标的检测,包括凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤/白血病-2（B-cell lymphoma/leukemia-2 BCL-2）,前凋亡蛋白BAX,半胱氨酸基天冬氨酸特异性蛋白酶-3（Cysteinyl aspartate specific proteinase Caspase-3 ）的表达分析。6.检测GnRH拮抗剂对体外培养的人黄素化颗粒细胞结构及分泌功能的影响收集首次在西京医院妇产科辅助生殖中心行体外受精-胚胎移植（Invitro fertilization- embryo Plantation IVF-ET）的患者卵泡穿刺术后的黄素化颗粒细胞,进行分离、纯化、鉴定及培养。不同浓度的CTX（0ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml）和不同浓度西曲瑞克（0ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml）与人颗粒细胞共同孵育24h后,同时不同浓度的西曲瑞克（10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml）联合孵育于化疗药物1000ng/ml前24h及化疗中24h。处理结束后,MTT比色法检测不同药物处理组的颗粒细胞的抑制率;对药物处理后的细胞进行Hoechest33258染色,检测颗粒细胞的存活状态;透射电镜技术检测药物处理后各组颗粒细胞超微形态结构的变化;ELISA法检测药物处理后颗粒细胞培养液中E2、孕酮（Progesterone P4）水平。研究结果:1.成功构建稳定的化疗损伤性POF动物模型经过一系列药物浓度筛选,结果表明CTX的卵巢毒性作用与药物剂量呈正相关,其中20mg/kg.d连续使用20天的实验剂量最符合临床POF病理学改变:卵巢明显纤维化、出血、坏死,各级卵泡数目显著减少,特别是成熟卵泡和生长卵泡;大鼠动情周期紊乱,动情期及动情前期缩短,总周期数较少,主要表现为持续的动情间期;血清E₂水平较低、FSH水平升高;同时心、肝、肾,肺等重要脏器未出现明显出血、坏死等病理学变化。该模型用药剂量和时间与临床化疗中维持最小安全剂量用药的要求完全相一致,为下一步实验研究奠定了基础。2.GnRH拮抗剂（西曲瑞克）的剂量-效应关系分析西曲瑞克的药物-剂量效应关系表明,西曲瑞克对性腺轴具有可逆性抑制作用,并且与药物剂量呈正相关,其中3μg/d,5μg/d,连续使用10天可完全抑制大鼠性腺轴功能,表现为FSH、LH持续较低水平,停药后FSH、LH激素水平迅速上升,10天内可完全恢复正常,因此西曲瑞克3μg/d,5μg/d均为安全有效剂量。这与西曲瑞克药理学研究相符,即西曲瑞克当使用临床最低有效剂量0.25mg/d时,可以使抑制作用持续,并且该药物浓度既对雌二醇分泌及卵泡发育无负面影响,通过人与动物用药的换算公式（人与大鼠等效剂量换算系数为6.25）计算出大鼠有效性腺抑制剂量为5μg/d。3.西曲瑞克对化疗大鼠卵巢功能的保护作用西曲瑞克5μg/d联合应用于化疗（CTX20mg/kg.d）前10天和化疗中20天,能够保存了卵巢组织中大部分原始卵泡,使得总卵泡数基本不变,处于静止期的卵泡可免受化疗药损害,保存卵巢储备功能,同时卵巢组织纤维化程度降低,出血、坏死现象明显减轻;停药10天后原始卵泡能够继续发育成熟,血清性激素（FSH、E₂）恢复至正常水平;大鼠体重增加,卵巢湿重增加,并且饮食、饮水等一般情况明显改善。4.西曲瑞克对化疗大鼠生殖功能及子代胎鼠生长发育的影响单独化疗后妊娠的大鼠于GD₁₂和GD₁₄出现短暂的体重下降,在GD₁₇恢复正常,并且妊娠率下降,20%化疗后的雌鼠交配后未妊娠,妊娠成功的孕鼠胎仔中出现11.4%死胎和14.3%吸收胎,活胎数目减少。而西曲瑞克联合用药后可明显改善化疗后孕鼠的体质量,提高雌鼠妊娠率,降低死胎率、吸收胎率（西曲瑞克联合用药组雌鼠妊娠率可达100%,并且全部为活胎）。此外,各组药物对大鼠双侧卵巢黄体数、子宫着床数,亲代活胎鼠体重、身长、尾长、性别比（雄性%）,仔鼠外形、内脏、骨骼发育没有明显影响。5.GnRH拮抗剂对化疗损伤性POF的预防作用与卵巢颗粒细胞线粒体凋亡途径的相关性凋亡检测结果提示:化疗后的卵巢生长卵泡及成熟卵泡颗粒细胞凋亡增加,而原始卵泡颗粒细胞的凋亡不明显;西曲瑞克联合用药后原始卵泡比例显著增加,并且能够显著降低化疗所致原始卵泡卵巢颗粒细胞凋亡。观察颗粒细胞超微结构发现,化疗后颗粒细胞出现明显凋亡特征,最明显的改变为线粒体数目减少、结构肿胀、嵴断裂甚至空泡变;而西曲瑞克联合用药后线粒体数量增加,结构较完整。检测颗粒细胞线粒体膜电位:结果发现化疗后大鼠卵巢颗粒细胞线粒体膜电位显著下降,西曲瑞克联合性应用后线粒体电位较正常。检测Cyt-C在卵巢线粒体及胞质的空间分布发现:化疗损伤颗粒细胞线粒体膜电位水平,并且使得Cyt-C在胞浆内聚集,西曲瑞克的预防性应用能够有效阻止Cyt-C空间分布的改变将凋亡扼杀在较早期阶段。BAX、caspase-3、Bcl-2凋亡相关蛋白检测结果提示:西曲瑞克联合用药后能够明显扭转化疗引起的BAX、caspase-3在卵泡颗粒细胞中的高表达,及Bcl-2低表达。6.GnRH拮抗剂对离体人黄素化颗粒细胞结构及分泌功能的保护作用CTX与人颗粒细胞共同孵育24h后,颗粒细胞的超微结构遭破坏,表现为坏死或凋亡;细胞生长抑制率随着化疗药物的浓度增加而上升,而培养液E₂、P₄水平随着化疗药物的浓度增加而降低。西曲瑞克与人颗粒细胞共同孵育后,刺激颗粒细胞各种细胞器增长,同时保持旺盛的分泌功能,E₂、P₄水平较高。西曲瑞克联合孵育于化疗前24小时后,颗粒细胞的超微结构可避免化疗药物破坏,颗粒细胞生长抑制率降低,E₂、P₄水平提高,并且与西曲瑞克药物浓度呈剂量依赖关系。结果提示:排除下丘脑-垂体的影响后,GnRH拮抗剂能够在卵巢局部对颗粒细胞发挥直接保护作用。结论:1.实验中采用CTX 20mg/kg.d连续使用20天的实验剂量成功构建稳定的化疗损伤性POF大鼠模型。该模型成模时间短,卵巢组织结构、内分泌功能改变与人类POF极为相符,并且药物剂量和时间与临床化疗中维持最小安全有效剂量的要求一致;2.高效剂量的GnRH拮抗剂预防性应用于化疗前和化疗同时,对大鼠卵巢功能、生育功能、胚胎发育具有一系列的保护作用,增强卵巢的储备能力,改善卵巢内分泌功能和组织纤维化、坏死程度。同时GnRH拮抗剂的预防性应用可以提高化疗后大鼠的妊娠能力,降低死胎和吸收胎的发生率,提示促性GnRH拮抗剂能够改善化疗患者远期生活质量;3.GnRH拮抗剂对化疗损伤性POF的预防作用与抑制卵巢颗粒细胞线粒体凋亡途径及凋亡相关基因BAX、caspase-3、Bcl-2表达密切相关;4.GnRH拮抗剂可直接刺激体外培养的人黄素化颗粒细胞各种细胞器数目增加、功能增强,从而改善化疗后所致颗粒细胞内分泌功能降低。