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目的:研究表明上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)与糖尿病肾病(Diabetickidney disease,DKD)的发病机制密切相关。雷公藤甲素具有抗炎和免疫抑制作用,并且能够减轻DKD、降低尿蛋白水平。近年来,微小RNAs(microRNAs,miRNAs)作为DKD的重要调控因素,已成为生命医学领域的研究热点。然而雷公藤甲素是否能通过调节肾脏miRNAs的表达抑制EMT从而保护DKD的研究在国内外至今尚未涉及。因此,本研究从动物水平和细胞水平出发,旨在明确雷公藤甲素在DKD中可能的作用及机制,探讨其是否通过调节miRNAs的表达从而改变下游信号通路的活性来减轻DKD的肾脏EMT过程。方法:1、动物水平:饲养60只SD大鼠,随机选取其中15只为正常对照组(NC组,n=15)喂养普通饲料,其余大鼠喂养高糖高脂饲料联合尾静脉注射链脲佐菌素(Streptozocin,STZ)构建糖尿病(Diabetes mellitus,DM)模型。已成模大鼠随机分DKD组(n=15)和DKD+TP组(n=15)。DKD+TP组用雷公藤甲素灌胃治疗12周,而NC组和DKD组以等量生理盐水灌胃。饲养终末阶段留24小时尿,测尿微量白蛋白(Urinary microalbuminuria,UMA)水平;处死阶段测体重和肾重,并留血标本测血糖、血脂和肝肾功能;进行HE、PAS和Masson染色观察肾组织病理改变;采用免疫组化法观察EMT指标的表达;应用Western Blotting法观察大鼠肾组织EMT指标、PTEN及PI3K/AKT通路信号分子的蛋白表达;应用RT-PCR法测大鼠肾组织miR-188-5p的表达。2、细胞水平:以人近端肾小管上皮细胞(HK-2细胞)为研究对象,应用CCK 8法确定雷公藤甲素干预的最佳治疗浓度。实验分为4组:正常糖组(NG)、甘露醇组(MA)、高糖组(HG)和雷公藤甲素治疗组(HG+TP)。通过光镜观察细胞的形态变化;采用免疫荧光和RT-PCR法观察细胞EMT指标的mRNA和蛋白表达;采用Western Blotting法观察细胞EMT指标、PTEN及PI3K/AKT通路信号分子的蛋白表达;使用PI3K抑制剂LY294002验证高糖条件下p-AKT的活性和EMT指标的蛋白表达;通过RT-PCR法检测miR-188-5p和PTEN的基因表达;通过TargetScan预测可能与miR-188-5p作用的靶基因;应用双荧光素酶报告基因实验验证miR-188-5p与PTEN的相互作用。细胞转染实验分为NG组、HG组、HG+空转组(miR-iNC)、HG+miR-188-5pinhibitor组(miR-188-5pi)、HG+TP组、HG+TP+空转组(miR-mNC)和HG+TP+miR-188-5pmimics组(miR-188-5pm)。采用RT-PCR法检测转染后miR-188-5p的表达;采用Western Blotting法检测EMT指标、PTEN和PI3K/AKT通路信号分子的蛋白表达。结果:1、与NC组相比,DKD组大鼠体重明显减轻,血糖、血脂水平、肾重体重比和UMA水平显著升高(P<0.05),而雷公藤甲素显著降低了 DKD大鼠的肾重体重比和UMA水平(P<0.05),但对其体重、血糖和血脂水平没有显著影响(P>0.05)。各组大鼠间的肝肾功能指标均无显著性差异(P>0.05)。2、与NC组相比,HE染色显示DKD组肾小球体积增大,系膜基质扩张,肾小管肿胀变形;PAS染色显示DKD组肾组织糖原沉积增加,肾小球更为明显;Masson染色显示DKD组肾脏纤维组织增多,肾小管肾间质纤维化明显,而雷公藤甲素干预后上述肾脏的病理改变均减轻。3、免疫组化染色和WesternBlotting结果均显示:与NC组相比,DKD组大鼠肾脏肾小管EMT加重、PTEN表达显著减少、PI3K/AKT通路活性明显增加(P<0.05);与DKD组相比,DKD+TP组大鼠肾脏EMT有所改善、PTEN表达升高、PI3K/AKT通路活性降低(P<0.05)。4、与对照组相比,低浓度(≤5ng/mL)的雷公藤甲素对HK-2细胞的存活率无显著影响(P>0.05),如果浓度≥7.5ng/mL时,细胞存活率显著降低(P<0.05)。5、NG组HK-2细胞表现为鹅卵石样的上皮细胞形态,HG组则转化为长梭型样的间质细胞形态,雷公藤甲素干预后细胞重新获得上皮细胞的形态。免疫荧光、RT-PCR和Western Blotting结果均显示:与NG组相比,HG组细胞EMT水平上调、PTEN表达减少、PI3K/AKT通路活性明显增加(P<0.05);与HG组相比,雷公藤甲素使细胞EMT水平明显下调、PTEN表达升高、PI3K/AKT通路活性降低(P<0.05);甘露醇对照与NG组相比,上述变化均无明显差异(P>0.05)。6、与HG组相比,LY294002可以抑制p-AKT的激活并且减轻了 HK-2细胞的EMT水平(P<0.05)。7、DKD组大鼠肾脏miR-188-5p水平高于NC组(P<0.05),而DKD+TP组miR-188-5p的表达显著低于DKD组(P<0.05)。与NG组相比,HG组细胞的miR-188-5p表达明显增多(P<0.05)、PTEN的mRNA水平显著减少(P<0.05);与HG组相比,HG+TP组miR-188-5p表达明显下降(P<0.05)、PTEN的mRNA表达显著升高(P<0.05)。8、TargetScan预测结果显示PTEN的3’-非翻译区(3’-untranslatedregion,3’-UTR)从 762-768 位可以与 miR-188-5p 序列互补结合。双荧光素酶报告基因实验证实了 miR-188-5p过表达能降低野生型PTEN3’-UTR质粒的荧光素酶活性(P<0.05),而对突变型PTEN-3’-UTR质粒无明显作用(P>0.05)。9、细胞转染miR-188-5p抑制剂后,miR-188-5p的表达降低了近60%(P<0.05)。当miR-188-5p表达被抑制后,PTEN表达升高、PI3K/AKT通路活性和EMT水平下降(P<0.05)。10、细胞转染miR-188-5p激动剂后,miR-188-5p的表达升高了约45倍(P<0.05)。miR-188-5p过表达使PTEN表达下降、PI3K/AKT通路活性和EMT水平升高(P<0.05)。结论:1、雷公藤甲素降低了 DKD大鼠的UMA水平并能改善其肾脏病理改变,在动物和细胞水平均能通过PI3K/AKT通路减轻肾小管上皮细胞的EMT。2、雷公藤甲素降低了 DKD大鼠肾组织和HG诱导的HK-2细胞miR-188-5p水平的升高。miR-188-5p是通过与PTEN 3’-UTR的直接作用从而影响PI3K/AKT通路的活性。3、miR-188-5p低表达通过使PI3K/AKT信号通路失活从而减轻HG诱导的EMT。miR-188-5p过表达通过使PI3K/AKT信号通路激活从而逆转了雷公藤甲素的抗EMT作用。