家禽的卵巢中,同时存在不同直径的卵泡。卵泡作为卵巢的基本功能单位,其发育是一个受到精密调节的循序渐进过程。卵泡由卵母细胞和卵泡细胞(颗粒细胞和膜细胞)组成,卵泡之间和卵泡细胞之间的相互调节,形成了一个错综复杂的系统。在卵泡发育的过程中,绝大部分的卵泡发生闭锁而不能发育至排卵。产蛋量是评价家禽品种及个体质量的关键指标,对于不同发育阶段的卵泡进行深入研究,显得尤为重要。本实验以鸡为研究对象,通过观察和研究鸡卵巢中卵泡库的动态变化,建立卵巢和卵泡的体外培养模型,研究雌激素(17β雌二醇,E2)和转化生长因子β1(TGF-β1)在雏鸡和青年鸡卵巢发育中的调节作用并探究其机制,为家禽繁殖性能的研究提供理论依据。1.鸡卵巢早期发育的组织学研究家禽卵泡的发育是一个连续且快速发育的复杂过程,本章通过采用组织学方法研究胚胎期、出壳后早期、1～4wk以及1～4月龄的鸡卵巢组织的形态变化。结果表明:出壳后3～4d内,生殖细胞簇破裂形成原始卵泡,进而原始卵泡转变发育为生长卵泡。对1～4wk的雏鸡卵巢形态观察,卵巢中从没有卵泡结构发育至卵泡充满于整个卵巢组织的皮质。与此同时,卵泡中的颗粒细胞从扁平变至立方,从单层增殖到多层,膜层从无到有。卵泡的数目统计结果表明,4wk雏鸡中生长卵泡的数目约是1wk雏鸡的4倍。在雏鸡卵巢中观察到多核卵泡的有趣现象,卵巢中的多核卵泡可以分为三类:1)对称卵泡,同体积卵母细胞的多核卵泡;2)不对称卵泡,一大一小卵母细胞的多核卵泡;3)融合卵泡,后期形成的融合卵泡,此类卵泡通过卵泡体外培养实验得到了验证。1～4月龄的鸡卵巢组织体积显著增大,已有少数小白卵泡(SWF)凸出于卵巢组织表面。同时,卵母细胞和卵泡的直径发生了显著变化。以上结果表明,鸡卵巢早期的发育是以卵泡库的动态变化为主,卵母细胞和卵泡细胞的生长发育为中心的生长过程。2.E2对鸡原始卵泡发育和激活的影响原始卵泡库的建立,对卵泡的选择和排卵以及维持雌性动物的繁殖性能是至关重要的。卵泡库形成的过程受到内/自/旁分泌因子的精确调节。类固醇激素和激素受体在家禽生殖和发育中具有重要作用。17β雌二醇(E2)对雌性动物的卵巢发育具有重要调节作用。在本实验中,对出生后3天(3d)的雏鸡体内注射不同剂量浓度的E2(0.025、0.25或2.5 mg/kg),处理4天后观察E2对雏鸡卵巢发育的调节作用。形态学观察结果表明2.5 mg/kg剂量浓度的E2,与对照组相比,分别增加了 28.5%的生长卵泡和8.9%的激活卵泡数(P<0.05)。同时,E2处理后增加了卵泡和卵母细胞的直径和面积。E2对卵泡发育的促进作用可被雌激素受体抑制剂他莫昔芬(Tamoxifen,TAM)减弱。TAM组与E2组相比,降低了14.3%的生长卵泡数(P<0.05)和5.8%的激活卵泡数。PCNA免疫组织化学染色结果进一步证实,E2能促进卵巢中卵泡细胞的增殖,统计结果表明E2处理组中阳性颗粒细胞比对照组上调了 14%,阳性卵泡间质细胞比对照组上调了21.5%。免疫印迹实验检测PCNA蛋白,E2处理组中,该蛋白的表达量显著上调(P<0.001)。采用RT-PCR检测了体内外实验中雌激素受体和钙粘蛋白基因的表达,结果表明E2处理后,相关基因的表达均有一定程度的上调。以上研究结果表明E2通过增加雌激素受体和E及N型钙粘蛋白的表达,促进卵泡颗粒细胞和间质细胞的增殖,从而促进雏鸡原始卵泡的发育和激活。3.TGF-β1对鸡原始卵泡发育中的调节作用在雌性的生殖使命中,原始卵泡的形成和激活对于原始卵泡库的库容是非常重要的。卵泡发育的过程受到多种细胞因子、激素和信号通路的精密调节。TGF-β1超家族中的很多家族成员对卵巢功能的维持具有重要的调节作用。TGF-β1和TGFRβ1定位表达于多种物种的卵巢细胞中。在禽类中,TGF-β1是否具有调节生殖细胞簇的破裂和原始卵泡的发育研究较少。在本实验中,出壳后5d的雏鸡体内注射不同剂量的TGF-β 1(2.5,12.5和62.5 μg/kg或PBS作为对照,0.1 mL)处理3天,探究TGF-β1在早期雏鸡卵巢中卵泡发育的调节作用。卵泡数目的统计结果表明12.5 μg/kg的TGF-β1处理雏鸡卵巢,显著增加了生殖细胞簇的单位面积数量和降低了原始卵泡和生长卵泡的数量(P<0.05)。TGF-β1处理后下降了卵泡和卵母细胞的直径与面积。细胞增殖核抗原PCNA免疫组织化学染色结果表明颗粒细胞和间质细胞的阳性率分别比对照组减少了 16.2%(P<0.05)和2.48%(P<0.001)。PCNA免疫印迹结果也同样证实了 TGF-β1对早期卵泡发育的负调节作用。采用卵巢组织体外培养模型进行实验,10 ng/mL的TGF-β1处理培养的卵巢组织后生殖细胞簇的数量有所增加,原始卵泡和生长卵泡的数量相对减少(P<0.05)。但是TGF-β1对早期卵泡发育的负调节作用能被TGF-β1受体的抑制剂SD208拯救。荧光定量检测了相关基因的表达情况,其中类固醇激素合成酶和细胞周期调节蛋白的表达在SD208处理后,相比TGF-β1处理组表达量上调。以上研究结果表明TGF-β1通过抑制卵泡细胞的增殖和卵泡早期发育相关调节基因的表达,抑制生殖细胞簇过度破裂,维持原始卵泡库的库容。4.鸡生长卵泡的分离和体外培养模型的建立在哺乳动物中,卵母细胞和不同级别大小的卵泡已经得到成功分离和建立体外培养模型。在禽类中,由于禽类生长卵泡的体积远远大于哺乳动物生长卵泡的体积,导致建立培养模型的难度增加。在本实验中,采用三种不同的分离家禽卵泡的实验方法,分别是酶消化法(胰蛋白酶和Ⅰ型胶原酶)和机械分离法,通过比较分离得到的卵泡质量和数量,建立最佳的卵泡培养模型。采用机械分离法分离得到83.5%的完整卵泡,而胰蛋白酶消化法和Ⅰ型胶原酶法分别分离得到63.4%和54.7%的完整卵泡。酶消化法可以分离得到的卵泡数量是275.7个/卵巢(Ⅰ型胶原酶法)和261.0个/卵巢(胰蛋白酶法),显著高于机械分离法(126.0个/卵巢)。将机械分离法得到的卵泡(800 μm)用于卵泡培养模型的研究。立体培养模型(3D)中的卵泡在体外培养7d后全部存活,平面培养模型(2D)中的卵泡在培养7d后仅有92.6%的卵泡存活。此外,通过掺入BrdU检测培养卵泡的细胞增殖和TUNEL标记凋亡细胞,结果表明3D模型中增殖细胞的数量明显高于2D模型;3D模型中凋亡细胞的数量显著低于2D模型。电镜观察培养卵泡的显微结构,3D模型中颗粒细胞紧密有序的排列,2D模型的颗粒细胞排列松散。卵泡刺激素(FSH)处理3D培养模型中的卵泡3d后,类固醇激素合成酶、细胞因子和细胞周期调节蛋白的基因表达水平均显著上调。以上结果表明,采用机械分离法对家禽卵泡进行分离的效率显著高于酶消化法,同时立体培养模型比平面培养模型更适合卵泡的体外生长。5.E2和TGF-β1对体外培养卵泡发育的调节作用在卵泡研究中,对原始生殖细胞和等级卵泡的研究较多,而对生长卵泡的研究较少。卵泡的发育是一个受到多种细胞因子和类固醇激素精密调节的复杂过程。本实验中,通过检测分离的三个级别卵泡(400、800和1600 μm)中孕酮(P4)、睾酮(T)和雌二醇(E2)的水平,检测结果表明P4的含量随着卵泡的发育逐渐增加;T的含量随着卵泡的发育逐渐降低;E2的含量在三个级别的卵泡中无显著差异。利用卵泡的体外立体培养模型,E2(0、10、100、1000 ng/mL)作用于培养卵泡5d,通过BrdU染色标记阳性增殖细胞,结果表明100ng/mL处理组能显著促进细胞增殖。TUNEL标记凋亡细胞实验表明该剂量组能明显抑制细胞凋亡。荧光定量检测相应激素受体(ERα、FSHR、LHR)和类固醇激素合成酶(Cyp19α1)的基因表达变化,结果表明E2(100ng/mL)能显著上调以上基因的表达水平。ERα的特异性阻断剂ICI182780,处理培养卵泡后能阻断E2对卵泡的调节效应,BrdU标记阳性增殖细胞减少,下调ERα和FSHR的基因表达水平。E2和 TGF-β1(100 ng/mL)联合作用于卵泡,对卵泡的体外生长发挥协同作用。用TGFβR1的特异性阻断剂SD208与TGF-β1联合作用于培养卵泡后,能显著下调Nr5α1和Cyp19α1以及细胞周期调节蛋白的基因的表达水平。以上研究结果表明E2和TGF-β1通过促进细胞增殖和相关激素受体的表达水平促进卵泡发育。类固醇激素和细胞因子的联合作用,能发挥协同作用促进卵泡生长。本实验通过观察鸡卵巢组织的形态学变化,阐明家禽卵巢的发育是以卵泡库的动态变化为主,卵母细胞和卵泡细胞的发育为中心的发育过程;通过建立卵巢组织的体外培养模型,研究雌激素(E2)和转化生长因子β1(TGF-β1)对早期雏鸡卵巢中原始卵泡的形成和激活的调节作用;通过比较多种分离卵泡的方法和培养模型,揭示机械分离法结合三维培养是适宜家禽较大体积生长卵泡的体外生长发育。通过将E2和TGF-β1联合作用于体外培养卵泡,能发挥协同作用促进卵泡的生长发育。这些结果将为研究家禽卵泡生长发育的调节机理及提高家禽繁殖性能奠定重要的理论基础。