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背景急性髓性白血病是一种全球范围内的血液系统恶性肿瘤,由于多功能造血干细胞异常引起,多功能造血干细胞异常可以直接诱导不成熟细胞在骨髓中大量积累,从而诱发急性髓性白血病。在过去30年中的研究显示,急性髓性白血病患者总体的生存率从15%已经提高到40%以上,但多数患者仍然死于急性髓性白血病复发。急性髓性白血病的发病机制极其复杂,是细胞内多个基因共同调控的结果,明确其发病机制是急性髓性白血病治疗和诊断的基础。随着人们对急性髓性白血病分子发病机制的不断研究发现,肿瘤细胞恶性表型与细胞内的微小RNA（microRNA,miRNA）等的异常表达有关,这些miRNA在肿瘤患者中常常呈现异常高表达或低表达。miRNA在真核生物体中广泛存在,其是大小为20～25个核苷酸的内源性小RNA分子的总称,这些miRNA因不具备开放阅读框不能编码蛋白质,但其可以通过碱基互补配对的方式与靶基因的mRNA结合,并根据其互补程度影响靶mRNA的翻译和表达。miRNA在人类生命体中普遍存在,这些miRNA多参与调控组织分化、细胞生长、胚胎发育等生命活动,并且还与疾病的发生有关。目前在肿瘤中的研究显示,miRN A扮演重要角色,与肿瘤进展、复发等具有密切联系。急性髓性白血病是一种常见的血液系统恶性肿瘤,其病理过程也受到多个miRNA的调控。miR-34a是miR-34家族的成员之一,其在人类的不同组织中的表达程度不同,miR-34a由22个碱基组成,其基因定位于1p36.23上,miR-34a可以通过与靶基因5’或3’UTR结合影响下游相关蛋白的表达。目前在多发性骨髓瘤、白血病、胶质瘤等肿瘤中已经发现miR-34a功能缺失或表达下降,miR-34a可以通过调控不同的靶基因影响细胞的凋亡、自噬等生物学过程。本次实验研究探讨miR-34a在急性髓性白血病细胞和人正常细胞HS-5中的表达差异,并探讨miR-34a mimics对急性髓性白血病细胞凋亡及自噬的影响,并通过靶基因预测探究miR-34a调控机制,为研究急性髓性白血病的发病机制提供参考。第一部分miR-34a对HL-60和THP-1细胞凋亡和自噬影响目的研究miR-34a在人急性髓性白血病细胞HL-60、THP-1和人正常基质细胞HS-5中的表达变化,明确miR-34a mimics对人急性髓性白血病细胞凋亡及自噬的影响,为研究急性髓性白血病发生机制提供参考。方法取人急性髓性白血病细胞HL-60、THP-1和人正常基质细胞HS-5,用定量即时聚合酶链锁反应（Quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR）检测g细胞中miR-34a表达变化;HL-60、THP-1细胞用含有10%胎牛血清的RPMI1640细胞培养液培养,将细胞分成 NC（negative control）、miR-control（转染 miR-control）、miR-34a mimics（转染 miR-34a mimics）共 3 组,膜联蛋白 V-FITC（Annexin V-FI TC）/碘化丙啶（Propidium Iodide,PI）凋亡试剂盒检测细胞凋亡变化,Western blot检测细胞中凋亡蛋白Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 Associated X Protein,Bax）、B细胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/lewkmia-2,Bcl-2）、细胞色素 C(Cytochrome C,Cyt C和自噬蛋白自噬相关基因5（autophagy—relatedgene5,Atg5）、微管相关蛋白 1 轻链 3 Ⅰ（microtubule-associated protein 1 light 3 Ⅰ,LC-3 Ⅰ）、微管相关蛋白1 轻链 3 Ⅱ（microtubule-associated protein 1 light 3 Ⅱ,LC-3 Ⅱ）表达变化。结果miR-34a在人急性髓性白血病细胞HL-60和THP-1和人正常基质细胞HS-5中的表达量:培养人急性髓性白血病细胞HL-60、THP-1和人正常基质细胞HS-5,qRT-PC R检测miR-34a的表达量,结果显示,miR-34a在人正常基质细胞HS-5和人急性髓性白血病细胞HL-60、THP-1中的表达量分别为1.00±0.09、0.48±0.05、0.53±0.07;统计学分析显示,HL-60、THP-1细胞中miR-34a表达水平低于HS-5细胞（P＜0.05）。上调miR-34a对HL-60和THP-1细胞凋亡影响:流式细胞术检测转染miR-34a mi mics后细胞凋亡变化;HL-60细胞NC组、miR-control组、miR-34a mimics组细胞的凋亡率分别为（2.15±0.36）%、（2.26±0.41）%、（23.84±3.58）%;THP-1细胞N C 组、miR-control 组、miR-34a mimics 组细胞的凋亡率分别为（2.96±0.36）%、（3.01±0.46）%、（17.69±1.52）%;统计学分析显示,与 miR-control 组相比,miR-34a mimics组细胞凋亡率显著增加,表明上调miR-34a明显促进HL-60以及THP-1细胞的凋亡（P＜0.05）。上调miR-34a对HL-60和THP-1细胞中凋亡蛋白Bax、Bcl-2、CytC表达影响:W estern blot测定各组细胞中Bax、Bcl-2、CytC蛋白表达变化;HL-60细胞NC组、m iR-control 组、miR-34a mimics 组细胞中 Bax 蛋白水平分别为 1.00±0.08、1.01±0.09、2.82±0.23,Bcl-2 蛋白水平分别为 1.00±0.09、1.00±0.07、0.47±0.04,CytC 水平分别为 1.00±0.08、0.99±0.08、2.89±0.32;THP-1 细胞 NC 组、miR-control 组、miR-34a mimics 组细胞中 Bax 蛋白水平分别为 1.00±0.09、1.00±0.07、2.65±0.28,Bcl-2 蛋白水平分别为 1.00±0.07、0.98±0.09、0.41±0.06,CytC 水平分别为 1.00±0.09、1.01±0.07、2.76±0.30;统计学分析显示,与miR-control组相比,miR-34a mimics组细胞中B ax、CytC蛋白表达水平升高,Bcl-2蛋白表达水平降低（P＜0.05）。上调miR-34a对HL-60和THP-1细胞中自噬蛋白Atg5、LC-3 Ⅰ、LC-3 Ⅱ表达影响:Western blot测定各组细胞中Atg5、LC-3 Ⅰ、LC-3 Ⅱ蛋白表达变化;HL-60细胞NC组、miR-control 组、miR-34a mimics 组细胞中 Atg5 蛋白水平分别为 1.00±0.10、0.99±0.09、0.45±0.03,LC-3 Ⅰ 蛋白水平分别为 1.00±0.11、1.04±0.13、0.63±0.05,LC-3Ⅱ水平分别为 1.00±0.08、1.02±0.12、0.36±0.03;THP-1 细胞NC 组、miR-control 组、miR-34a mimics 组细胞中 Atg5 蛋白水平分别为 1.00±0.09、1.03±0.12、0.43±0.05,L C-3 Ⅰ 蛋白水平分别为 1.00±0.10、0.97±0.09、0.68±0.07,LC-3 Ⅱ水平分别为 1.00±0.12、1.04±0.11、0.48±0.06;统计学分析显示,与 miR-control 组相比,miR-34a mimi cs组细胞中Atg5、LC-3 Ⅰ、LC-3 Ⅱ蛋白表达水平降低（P＜0.05）。结论miR-34a在人急性髓性白血病细胞中表达水平降低。上调miR-34a诱导HL-60和THP-1细胞凋亡并抑制其自噬。第二部分HMGB1对HL-60和THP-1细胞凋亡和自噬影响目的研究HMGB1在人急性髓性白血病细胞HL-60、THP-1和人正常基质细胞HS-5中的表达变化,明确HMGB1 siRNA对人急性髓性白血病细胞凋亡及自噬的影响,为靶向HMGB1治疗急性髓性白血病提供依据。方法取人急性髓性白血病细胞HL-60、THP-1和人正常基质细胞HS-5,用qRT-PCR和Western blot检测细胞中HMGB1表达变化;HL-60、THP-1细胞用含有10%胎牛血清的RPMI1640细胞培养液培养,将细胞分成NC、si-HMGB1（转染HMGB1 siR NA）、si-control共3组,Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒检测细胞凋亡变化,Weste rn blot检测细胞中凋亡蛋白Bax、Bcl-2、CytC和自噬蛋白Atg5、LC-3 Ⅰ、LC-3 Ⅱ表达变化。结果1.HMGB 1在人急性髓性白血病细胞HL-60和THP-1和人正常基质细胞HS-5中的表达量:培养人急性髓性白血病细胞HL-60、THP-1和人正常基质细胞HS-5,qRT-PCR和Western blot检测HMGB1的表达量,结果显示,HMGB1 mRNA在人正常基质细胞HS-5和人急性髓性白血病细胞HL-60和THP-1中的表达量分别为1.00±0.07、4.12±0.43、3.85±0.41;HMGB1 蛋白表达水平分别为:1.00±0.06、2.75±0.26、2.14±0.17;据统计学分析显示,HL-60、THP-1细胞中HMGB1表达水平高于HS-5细胞（P＜0.05）。2.下调HMGB1对HL-60和THP-1细胞凋亡影响:流式细胞术检测转染HMGB1 siRNA后细胞凋亡变化;HL-60细胞NC组、si-control组、si-HMGB 1组细胞的凋亡率分别为（2.56±0.15）%、（2.65±0.16）%、（16.84±1.52）%;THP-1 细胞 NC 组、si-control 组、si-HMGB1 组细胞的凋亡率分别为（2.74±0.18）%、（2.81±0.20）%、（16.32±0.28）%;统计学分析显示,与si-control组相比,si-HMGB1组细胞凋亡率显著增加,表明HMGB1 siRNA明显促进HL-60和THP-1细胞的凋亡（P＜0.05）。3.下调HMGB1对HL-60和THP-1细胞中凋亡蛋白Bax、Bcl-2、CytC表达影响:Western blot测定各组细胞中Bax、Bcl-2、CytC蛋白表达变化;HL-60细胞NC组、si-control 组、si-HMGB1 组细胞中 Bax 蛋白水平分别为 1.00±0.09、0.99±0.10、1.74±0.13,Bcl-2 蛋白水平分别为 1.00±0.08、1.02±0.09、0.51±0.05,CytC水平分别为 1.00±0.08、1.01±0.10、1.86±0.16;THP-1细胞NC组、si-control组、si-HMGB1组细胞中Bax蛋白水平分别为1.00±0.08、1.02±0.09、2.11±0.21,Bcl-2 蛋白水平分别为 1.00±0.09、0.99±0.10、0.39±0.04,CytC 水平分别为 1.00±0.07、1.00±0.08、1.98±0.17;统计学分析显示,与 si-control组相比,si-HMGB1组细胞中Bax、CytC蛋白表达水平升高,Bcl-2蛋白表达水平降低（P＜0.05）。4.下调HMGB1对HL-60和THP-1细胞中自噬蛋白Atg5、LC-3 Ⅰ、LC-3 Ⅱ表达影响:Western blot测定各组细胞中Atg5、LC-3 Ⅰ、LC-3 Ⅱ蛋白表达变化;HL-60细胞NC 组、si-control 组、si-HMGB1 组细胞中 Atg5 蛋白水平分别为 1.00±0.10、1.02±0.11、0.37±0.06,LC-3 Ⅰ 蛋白水平分别为 1.00±0.10、0.97±0.11、0.74±0.07,LC-3 Ⅱ水平分别为 1.00±0.09、1.03±0.11、0.46±0.05;THP-1 细胞NC 组、si-control 组、si-HM GB1 组细胞中 Atg5 蛋白水平分别为 1.00±0.12、0.99±0.13、0.44±0.04,LC-3 Ⅰ 蛋白水平分别为 1.00±0.11、1.02±0.13、0.71±0.08,LC-3 Ⅱ 水平分别为 1.00±0.11、1.05±0.10、0.38±0.05;统计学分析显示,与si-control组相比,si-HMGB1组细胞中Atg5、L C-3 Ⅰ、LC-3 Ⅱ蛋白表达水平降低（P＜0.05）。结论HMGB1在人急性髓性白血病细胞中表达水平上调。下调HMGB1诱导HL-60、T HP-1细胞凋亡并抑制其自噬。第三部分miR-34a靶向调控HMGB1影响急性髓性白血病细胞自噬和凋亡目的本研究主要探讨miR-34a靶向调控HMGB1对急性髓性白血病细胞自噬和凋亡的影响机制。方法靶基因预测软件Targetscan预测miR-34a的靶基因,构建野生型（wild type,WT）和突变型（mutant,MUT）荧光素酶报告基因,miR-34a mimics或miR-control与报告基因共转染,检测荧光素酶活性;将miR-34a mimics,miR-34a inhibitor或miR-c ontrol转染到HL-60和THP-1细胞,用qRT-PCR和Western blot检测细胞中HMGB 1 表达变化;人 HL-60 细胞分为 miR-control（转染 miR-control）、miR-34a（转染 m iR-34 mimics）、miR-34a+pcDNA-control（转染 miR-34a mimics和pcDNA-control）、miR-34a+pcDNA-HMGB1（miR-34a mimics 和 pcDNA-HMGB1）共 4 组,流式细胞术检测细胞的凋亡率,Western blot检测细胞中凋亡蛋白Bax、Bcl-2、CytC和自噬蛋白 Atg5、LC-3 Ⅰ、LC-3 Ⅱ 表达变化。结果1.miR-34a靶向调控靶HMGB1:Targetscan预测HMGB1可能是miR-34a的靶基因。miR-34a mimics和突变型WT荧光素酶报告基因共转染后细胞荧光素酶活性降低。H MGB1是miR-34a的靶基因。2.miR-34a mimics 和 miR-34a inhibitor 对 HMGB1 表达影响:转染 miR-34a mimi cs后的HL-60和THP-1细胞中HMGB1 mRNA和蛋白表达水平均降低,转染miR-34a inhibitor后的HL-60和THP-1细胞中HMGB1 mRNA和蛋白表达水平均升高。m iR-34a负调控HMGB1的表达和转录。3.转染miR-34a mimics和pcDNA-HMGB1对细胞凋亡的影响:流式细胞术检测各组细胞的凋亡率;结果显示,miR-control 组、miR-34a 组、miR-34a+pcDNA-control组、miR-34a+pcDNA-HMGB1 组凋亡率分别为（3.01±0.12）%、（19.65±1.76）%、（17.45±1.68）%、（4.82±0.34）%;经统计分析显示,与 miR-34a+pcDNA-control组相比,miR-34a+pcDNA-HMGB1组细胞凋亡率明显降低（P＜0.05）。4.转染 miR-34a mimics 和 pcDNA-HMGB1 对细胞中凋亡蛋白 Bax、Bcl-2、CytC表达影响:Western blot测定各组细胞中Bax、Bcl-2、CytC蛋白表达变化;miR-cont rol 组、miR-34a 组、miR-34a+pcDNA-control 组、miR-34a+pcDNA-HMGB 1 组细胞中 Bax 蛋白水平分别为 1.00±0.07、2.04±0.18、2.02±0.17、0.82±0.06,Bcl-2 蛋白水平分别为 1.00±0.09、0.48±0.06、0.50±0.05、1.35±0.15,CytC 水平分别为 1.00±0.06、2.13±0.20、2.01±0.19、0.81±0.07;经统计分析显示,与 miR-34a+pcDNA-control 组相比,miR-34a+pcDNA-HMGB 1组细胞中Bax、CytC蛋白表达水平降低,Bcl-2蛋白表达水平升高（P＜0.05）。5.转染 miR-34a mimics 和 pcDNA-HMGB1 对细胞中自噬蛋白 Atg5、LC-3 Ⅰ、LC-3Ⅱ表达影响:Western blot测定各组细胞中Atg5、LC-3 Ⅰ、LC-3 Ⅱ蛋白表达变化;miR-control 组、miR-34a 组、miR-34a+pcDNA-control 组、miR-34a+pcDNA-HMGB 1 组细胞中 Atg5 蛋白水平分别为 1.00±0.08、0.49±0.04、0.52±0.05、1.65±0.13,LC-3 Ⅰ 蛋白水平分别为 1.00±0.09、0.68±0.05、0.65±0.06、1.21±0.10,LC-3 Ⅱ水平分别为1.00±0.07、0.43±0.03、0.45±0.04、1.74±0.12;经统计分析显示,与 miR-34a+pcDN A-control 组相比,miR-34a+pcDNA-HMGB1 组细胞中 Atg5、LC-3 Ⅰ、LC-3 Ⅱ 蛋白表达水平升高（P＜0.05）。结论miR-34a靶向负调控HMGB1;miR-34a通过靶向调控HMGB1诱导细胞凋亡并抑制细胞自噬。