第一章异基因造血干细胞移植后Th17细胞重建及其临床意义的初步研究研究目的及背景最近的研究发现产生白细胞介素-17(interleukin-17,IL-17)的Th17细胞在自身免疫性疾病及炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)中的致炎作用,诱导了人们进一步探索其在异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation, allo-HSCT)并发症移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)中作用的兴趣。研究发现预处理后的细胞因子风暴在急性移植物抗宿主病的发病中发挥重要作用,且抗胸腺细胞球蛋白(Anti-thymocyte globulin, ATG)是异基因造血干细胞移植预处理中的主要免疫抑制剂,用于预防急性、慢性移植物抗宿主病。而以往研究急性GVHD的病理生理过程主要集中在Th1和其分泌的特征性细胞因子IFN-γ作用而介导aGVHD的发生,但是研究发现Th1和Th17细胞均不是引起急性GVHD的唯一效应性T细胞,而且Th17细胞及特征的细胞因子IL-17在GVHD发病中的作用目前存在争议。本文拟探讨异基因造血干细胞移植治疗血液系统疾病后,早期外周血Th17细胞以及与之密切相关的Th1、Treg细胞免疫重建及其相关的细胞因子,与含或者不含抗胸腺细胞球蛋白预处理方案的关系,以及Th17细胞重建与移植后并发症急性移植物抗宿主病和巨细胞病毒(Cytomegalovirus, CMV)激活的关系。方法对78例血液病患者在异基因造血干细胞移植术后,进行移植后患者外周血淋巴细胞计数,在移植后早期,采用多色流式细胞术检测外周血单个核细胞中各T淋巴细胞亚群Th1、Th17、非Thl/Th17(Non-Th1/Th17)、Th1/17细胞及调节性T(Treg)细胞比例、采用酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbentassay, ELISA)检测血清Th17/Treg细胞相关的细胞因子(IL-17、IL-23、IL-21、 IFN-γ、TGF-β1、IL-22)浓度,采用间接免疫荧光法检测巨细胞病毒抗原-pp65,健康志愿者作为对照(n=10)。然后进行以下研究：1.对移植后30-60天内无aGVHD,含或者不含抗胸腺细胞球蛋白(ATG)预处理的患者、及移植后110天内并发CMV激活者的外周血淋巴细胞、CD3+CD4+、CD3+CD4-、Th1、Th17、Th1/17、Non-Th1/17细胞绝对计数。2.不同程度的aGVHD与Treg(CD25+CD4+Foxp3+)细胞和Th17(IL-17+CD4+)细胞百分比、以及Th17/Treg比值的关系。3.发生aGVHD时血清中Th17相关的细胞因子(IL-17、IL-23、IL-21、IFN-γ、 TGF-β1、IL-22)的变化。4.急性GVHD患者有效治疗前后血清Th17相关的细胞因子(IL-17、IL-23、 IL-21、IFN-γ、TGF-β1、IL-22)浓度的变化。结果1.未并发aGVHD的T细胞重建情况：无论含(n=10)或者不含抗ATG(n=12)预处理方案组,各T淋巴细胞亚群(CD3+CD4-、CD3+CD4+、Th1、Th17、Th1/17和Non-Th17)绝对数均低于健康对照组,差异有统计学意义(p<0.05)；而外周血淋巴细胞总数：ATG组低于健康对照组和非ATG组,差异有统计学意义(p<0.05),而非ATG组虽然低于健康对照组,但是差异无统计学意义(p>0.05)。ATG组淋巴细胞、Th1、Th17、CD3+CD4+和Non-Th17细胞绝对值显著低于非ATG组,差异有统计学意义(p<0.05)；虽然Th1/17细胞绝对值在ATG组低于非ATG组(2.12±1.47VS4.45±2.70),但是差异无统计学意义(p>0.05)。2.CMV激活组(n=8)外周血淋巴细胞、CD3+CD4-、Th1、Th17、Th1/17细胞绝对值显著高于非激活组(n=10),差异有统计学意义(p<0.05)；但是Non-Th17细胞和CD3+CD4+细胞绝对值,两组差异无统计学意义(p>0.05)。3.随着aGVHD程度的加重,外周血中Treg细胞比例(%)逐渐下降：健康对照组(n=10)：4.80±1.14,0度急性GVHD组(n=10)：3.82±0.69,1-2度(n=12)：2.47±0.59;3-4度(n=8)：1.44±0.34。0度GVHD组和健康对照组,差异无统计学意义(p>0.05),1-2度急性GVHD组低于健康对照组比较,差异有统计学意义(p<0.05),3-4度急性GVHD组低于1-2度急性GVHD组,差异有统计学意义(p<0.05)。Th17细胞比例(%)逐渐升高：健康对照组：1.27±0.35,0度急性GVHD组：1.46±0.28,1-2度aGVHD组：1.94±0.31,3-4度aGVHD组：3.24±0.96；健康对照组和0度GVHD组比较,差异无统计学意义(p>0.05),1-2度急性GVHD组高于健康对照组,差异有统计学意义(p<0.05),3-4度aGVHD组均高于健康对照组、O度急性GVHD组和1-2度急性GVHD组,差异有统计学意义(p<0.05)。相应地,Th17/Treg比值逐渐升高：健康对照组：0.25±0.11：0度：0.38±0.22；1-2度：0.78±0.45；3-4度：2.34±0.79。1-2度组高于健康对照组,差异有统计学意义(p<0.05)；3-4度急性GVHD组高于其余各组,差异有统计学意义(p<0.05)。4. aGVHD者(n--12)血清中Th17细胞相关因子浓度(pg/ml)较正常对照组(n=10)和无aGVHD组(n=14)显著增高,差异有统计学意义(p<0.05)(IL-17:27.88±10.07vs9.85±3.72or10.38±6.62).(IL-23:201.67±66.54vs56.34±11.18or88.10±28.37)、(IL-21:201.67±66.54vs56.34±11.18or132.43±48.99)、(IFN-y:42.56±22.47vs23.42±8.78or21.78±6.93);而TGF-β1(1156.61±458.04)显著低于正常对照组(2978.34±1647.71)和无aGVHD组(2541.62±1805.16),差异有统计学意义(p<0.05)。IL-22：未发生GVHD组高于健康对照组(22.14±2.49VS19.18±1.24),差异有统计学意义(p<0.05)；除IL-21、IL-22和IL-23浓度高于健康对照组外(p<0.05),其余的细胞因子健康对组和无急性GVHD组均无统计学差异(p>0.05), aGVHD组血清IL-22浓度与Non-GVHD和健康对照组比较差异无统计学意义(p>0.05)。5.10例有效治疗者,治疗后均有恢复,治疗前后有统计学意义(p<0.05)：(IL-17:11.85±3.81vs6.48±1.89; IL23:46.35±11.11vs29.42±7.14; IL-21:280.20±66.86vs148.78±49.28; IFN-y:47.46±12.83vs36.31±6.66; TGF-β1:183.52±29.86vs223.32±29.86);而IL-22在有效治疗前后差异无统计学意义(22.61±1.27vs25.40±4.41)(p>0.05)。结论：1.预处理方案中ATG在移植早期延缓了Thl和Th17细胞的免疫重建。2.CMV激活促进了Th17及Thl细胞的免疫反应。3.外周血中Th17/Treg平衡预示着aGVHD的严重程度。4.Th17/Treg细胞相关的细胞因子与(IL-17、IL-23、IL-21、IFN-γ、TGF-β1)与aGVHD的发生发展和疗效有关,而与IL-22无关系。第二章IRF8抑制Th17细胞分化及减轻T细胞免疫介导小鼠实验性结肠炎的机制研究研究目的及背景：Th17细胞是近年来发现的独特的辅助性T淋巴细胞,其在自身免疫性疾病和组织炎症中发挥至关重要的致病作用,且发现其在异基因造血干细胞移植后的并发症移植物抗宿主病中也发挥重要作用。众所周知,尽管转录因子RORyt在Th17细胞的发育中是必须的,但是对于影响Th17细胞分化的分子机制仍然尚未完全阐明。干扰素调节因子(interferon regulatory factor,IRF)家族成员,如IRF4与Th17细胞发育密切相关,而干扰素调节因子8(interferon regulatory factor, IRF8)存在于多种类型细胞中,被IFN-γ所诱导,并调控B细胞、树突状细胞(DCs)、巨噬细胞的发育,并在先天性和过继免疫反应中显示出各种作用,然而IRF8在T细胞中的表达知之甚少,本研究拟探讨IRF8对Thl7细胞分化影响及其机制,以及对T细胞转染的免疫介导小鼠实验性肠炎的影响。方法一、IRF8基因敲除对小鼠Th17细胞分化的影响1.实验动物的选择：采用C57BL/6全基因(IRF8-/-)或者条件性T细胞特异性IRF8基因敲除(Lck-Cre+If8fl/fll的小鼠作为研究对象,每组5只小鼠。2.流式细胞术分选小鼠的naive CD4+(CD4+CD62L+CD44low)T细胞,免疫磁珠法分选CD4+CD25+调节性T细胞(Tregs)。3. Naive CD4+T的极化培养：细胞在不加细胞因子刺激的中性条件下培养为Th0细胞；加入IL-12和anti-IL-4为Thl细胞；加入IL-4和anti-IFN-y为Th2细胞；加入TGF-β1、IL-6、IL-23加或者不加anti-IL-4抗体、anti-IFN-y抗体为Th17细胞。4.采用ELISA法检测细胞因子的水平、定量PCR(qPCR)检测细胞因子及转录因子mRNA的水平,泛素基因作为标准,流式细胞术检测T细胞亚群。5.IRF8基因敲除对iaiveCD4+T细胞向Th17细胞分化的影响①TGF-β联合不同浓度的IL-6产生Th17细胞TGF-β(5ng/ml)加入不同浓度的IL-6(5,10,50,100ng/ml)培养3天,使用PMA/离子素再刺激5h,进行INF-γ和IL-17细胞内因子染色后,进行流式细胞术检测IL-17+CD4+T细胞和IFN-y+CD4+T细胞。②Th17极化培养对IL-17基因表达的影响分离的WT或者IRF8-/-小鼠的naiveCD4+T细胞加入IL-6、IL-23、TGF-p,在不同的培养时间点(24、48和72h),提取细胞总的RNA,采用RT-PCR检测IL-17mRNA和IL-17FmRNA水平。③不同的细胞因子组合培养对产生Th17细胞及IL-17的影响分离的WT或者IRF8-/-小鼠的naiveCD4+T细胞,加入IL-23刺激、或者IL-23/IL-6/TGF-P联合刺激,流式细胞术检测IL-17+CD4+细胞,ELISA法检测细胞培养上清液IL-17浓度。④不同的细胞因子组合培养对Th17细胞分化相关基因表达的影响分离自WT和IRF8-/-小鼠的naive CD4+T细胞采用TGF-β/IL-6或者TGF-βIL-21联合刺激48h,提取总的RNA,采用qPCR检测与Th17分化的相应分子IL-17A, IL-22、IL-23R、RORγt、CCR6的基因及Foxp3基因表达水平。6. IRF8基因敲除对Treg细胞发育的影响从WT或者IRF8-/-小鼠中分离naiveCD4+T细胞,同时加入IL-6(10ng/ml)和不同浓度的TGF-γ(0.1,1,5ng/ml),流式细胞术检测CD4+Foxp3+T细胞。二、转录因子IRF8作用于RORγt抑制IL-17启动子的活性1.激活的野生型小鼠naive CD4+T细胞中IRF8蛋白的表达：分离、分选小鼠脾脏中淋巴结中naiveCD4+T细胞,在Th1、Th2及Th17极化条件下培养、以及在无TCR刺激条件下加入TGF-p培养,采用蛋白质印迹技术检测IRF8蛋白。2.采用磷酸钙转染法,293T细胞共转染RORyt和IRF8基因后,采用蛋白质印迹技术(western-blot assay)、免疫共沉淀(Co-IP)检测转录因子RORy和IRF8蛋白的结合状态。3.293T细胞转染IRF8与RORγt质粒对IL-17启动子活性的作用采用脂质体转染法,在293T细胞转染包含6kb荧光素的IL-17启动子的基础上,分为以下三个组转染质粒：①293T细胞转染不同剂量RORγt质粒；②共转染不同剂量的IRF8质粒和RORγt质粒；③同时转RORyt质粒和Foxp3质粒。④同时转染RORyt质粒、IRF8的截断突变结构((1-390、1-305、1-253)；同时细胞通过共转染p-半乳糖苷酶报告基因质粒标准化实验来检测转染效率,检测荧光素酶的活性。4. naiveCD4+T细胞转染IRF8基因抑制Th17细胞的产生分离野生型C57BL/6小鼠的naiveCD4+T细胞,采用脂质体转染法,采用逆转录病毒转染IRF8-IRES-GFP或者空载体,在Th17极化条件下培养4天,收集细胞采用PMA/离子素刺激5h,进行细胞内因子IL-17染色,流式细胞术检测IL-17+CD4+T细胞。5. RORyt和IRF家族成员的相互作用①293T细胞中RORyt和IRF家族成员的相互作用293T细胞转染T7-tagged RORyt质粒和HA-tagged IRF家族基因(IRF8、IRF4、IRF1)或者IRF8截断体基因质粒40h,提取细胞裂解液,采用Co-IP检测RORyt与IRF8蛋白的结合状态及与IRF8蛋白氨基酸残基的结合状态。②IRF8基因对小鼠naive CD4+T细胞IRF4基因的影响分离WT或者IRF8-/-小鼠naive CD4+T细胞,加或者不加TGF-β/IL-6培养24h,采用qPCR检测IRF4mRNA水平。③小鼠naive CD4+T细胞中IRF8和RORyt蛋白的相互作用从WT或者小鼠的naiveCD4+T细胞在Th17极化条件下培养60h后,提取细胞裂解液,采用anti-IRF8抗体免疫共沉淀,采用anti-RORyt和anti-IRF8蛋白抗体进行免疫印迹。三、T细胞免疫介导的实验性肠炎模型的建立及观察每组5只小鼠,采用免疫磁珠法分选野生型(wild type,WT)或IRF8-/-小鼠中的脾脏和淋巴结中CD4+CD25+Treg,流式细胞术分选WT或者IRF8/-小鼠的CD4+CD45RBhiT细胞,CD4+CD45RBhiT细胞(5×105细胞／只)单独或者分别联合WT或IRF8-/小鼠的CD4+CD25+Treg(5×105细胞／只)腹腔注射给RAG1/-小鼠,观察上述小鼠每周体重的变化,第5周时处死小鼠,进行结肠炎临床、病理评分和肠系膜淋巴结淋巴细胞中IL-17+CD4+、IFN-γ+CD4+、Foxp3+CD4+淋巴细胞检测。结果：一、IRF8基因敲除促进小鼠Th17细胞分化1.IRF8基因敲除对小鼠Th细胞分化的影响①分离WT或者IRF8-/-小鼠的脾脏和淋巴结naiveCD4+T细胞,进行以下实验。在Th1、Th2和Th17极化的条件下培养,IRF8基因敲除对Th1和Th2细胞的比例无明显影响,差异无统计学意义(p>0.05),且培养细胞上清液IL-4和INF-y浓度差异无统计学意义(p>0.05)；而显著增加了IL-17+CD4+(Th17)细胞的比例(36.2±2.46vs12.12±0.96),差异有统计学意义(p<0.05)。②小鼠固有层淋巴细胞(LPLs)细胞在Th17极化条件下培养,产生IL-17+CD4+T细胞(%),IRF8-/-组也显著高于WT组(33.90±1.75vs15.60±1.29),差异有统计学意义(p=0.000),同样在Th17极化后,采用PMA/离子素刺激,也显示出IL-17+CD4+T细胞比例,IRF8-/-组显著高于WT组(10.24±0.28vs2.60±0.14),差异有统计学意义(p=0.000)。2.特异性T细胞IRF8基因敲除小鼠naiveCD4+T细胞极化培养Lck-Cre+Irf8fl/fl和Lck-Cre+Irf8wy/wt小鼠脾脏的naiveCD4+T细胞在Th17极化条件下培养,基因敲除组IL-17+CD4+T细胞比例显著高于野生型组(13.60±0.39vs5.13±0.24),差异有统计学意义(p=0.000),细胞培养上清液IL-17浓度,基因敲除组也高于野生型组(6.17.±0.10vs2.70±0.10)(ng/ml),差异有统计学意义(p=0.000)。3.Th17极化条件下小鼠naiveCD4+T细胞的细胞因子基因表达采用定量PCR检测Th17极化条件下的WT或者IRF8-／-小鼠的naiveCD4+T细胞因子基因,与WT组相比,IRF8-/-组IL-17(108076.00±96.77vs6769.00±106.13)、IL-17F(93207.00±44.98vs6663.61±240.61)、IL-22(3122.6±33.8vs372.4±16.9)的mRNA水平显著增高,差异有统计学意义(p<0.05)；而细胞因子IL-4(5529.26±63.45vs5562.61±583.61)和INF-γ(40375.00±433.69vs40333.00±102.04)的mRNA水平,两组差异无统计学意义(p>0.05)。4.IRF8基因敲除对Treg细胞发育的影响从WT或者IRF8-/-小鼠中分离naiveCD4+T细胞,同时加入IL-6(10ng/ml)和不同浓度的TGF-β(0.1,1,5ng/ml),结果显示,随着TGF-β浓度的增加,IRF8-/组产生IL-17+细胞显示明显的上升趋势,且IRF8-/-组较WT组增加更显著,差异有统计学意义(p<0.01),而产生Foxp3+细胞两组差异无统计学意义(p>0.05)。5.不同浓度TGF-β/IL-6刺激IRF8-/-naiveCD4+T细胞向Th17细胞分化的影响TGF-β(5ng/ml)加入不同浓度的IL-6(5,10,50,100ng/ml)培养3天,使用PMA/离子素再刺激5h,进行INF-γ和IL-17细胞内染色后,流式细胞术检测,结果显示,随着IL-6浓度的增加,两组产生Thl7细胞比例均有上升的趋势,但是IRF8-/组产生IL-17的细胞显著高于WT组,差异有统计学意义(p=0.000)；而随着IL-6浓度增高,IFN-γ+CD4+细胞比例无明显的变化,两组差异无统计学意义(p>0.05)。6.Th17极化培养对IL-17基因表达的影响分离的WT或者IRF8-/-小鼠的naiveCD4+T细胞加入IL-6.IL-23、TGF-β联合培养,结果显示,与WT组比较,IL-17mRNA和IL-17FmRNA水平,在极化培养24h(584.4±94.2vs146.1±8.8和2800.00±38.36vs1200.66±29.12)、48h(3798.80-45.8vs487.0±40.2和8400.31±652.7vs2332.88±205.35)和72h(6233.8±18.2vs1899.44±96.4和8000.02±392.93vs3732.76±553.17),IRF8-/-组均高于WT,差异有统计学意义(p=0.000)。7.不同的细胞因子组合培养对产生Th17细胞Naive CD4+T细胞,加入IL-23刺激产生IL-17的细胞比例,无论是WT组还是IRF8-/-组,均较对照组增加,IL-6/IL-23/TGF-β三者联合培养产生IL-17细胞增加更为显著,两组比较,对照组(4.03±0.10vs2.90±0.06)、加入IL-23刺激(13.8±0.86vs5.78±0.12)、或者IL-23/IL-6/TGF-β(72.2±4.13vs32.7±2.42)联合刺激,IRF8-/-组较WT组更为显著,差异有统计学意义(p=0.000)。8.不同的细胞因子组合培养对Th17细胞分化相关基因表达的影响分离自WT和IRF8-/-小鼠的naive CD4+T细胞采用TGF-β/IL-6或者TGF-β/IL-21联合刺激48h,结果显示无论TGF-β/IL-6或者TGF-β/IL-21刺激,IL-17A、IL-22、IL-23R、RORγ和CCR6的基因表达水平IRF8-/-组高于WT组,差异有统计学意义(p<0.05),但是Foxp3基因水平无明显变化,且两组之间统计学上无显著性差异(p>0.05)。二、转录因子IRF8拮抗RORyt抑制IL-17的转录1.激活T细胞中IRF8蛋白表达WT小鼠naiveCD4+T细胞在Th0、Thl、Th2和Thl7极化条件下培养,WB显示Th17极化条件下IRF8蛋白表达更为稳定；WT小鼠naiveCD4’T在无TCR刺激下,TGF-β同样诱导IRF8蛋白表达。WT或者IRF8-/-小鼠的naiveCD4+T细胞在Th17极化条件下培养60h,Co-IP显示]aaive CD4+T细胞内源性IRF8和RORγt相互结合。2.293T细胞中IRF8与RORγt相互作用抑制IL-17转录在转染的293T细胞中,IRF8呈剂量依赖性(2.5、5、7.5和10μg)抑制了IL-17启动子活性,而且Foxp3也抑制了IL-17启动子的活性；IRF8(Ful1、1-390、1-305、1-253)均抑制IL-171启动子的活性。3. RORγ和IRF8蛋白的相互作用免疫共沉淀显示：转染IRF8和RORγt质粒的293T细胞中IRF8和RORγt相互结合且与DNA无关,且IRF8的230-190氨基酸残基是与RORγt蛋白结合的主要区域。4. RORγt和IRF家族成员的相互作用293T细胞转染RORγt质粒和IRF家族基因(IRF1、IRF4、IRF8),免疫共沉淀显示IRF4、IRF8与RORγt相互结合,而IRF1和RORγt无结合。WT或者IRF8-/-小鼠naive CD4+T细胞,在无刺激或者TGF-β/IL-6刺激下,两组IRF4mRNA水平,在不同的时间点(0,24h)均无统计学差异(p>0.05)。5. NaiveCD4+T细胞转染IRF8基因抑制Th17细胞的产生分离WTC57BL/6小鼠的naiveCD4+T细胞,采用逆转录病毒转染IRF8-IRES-GFP或者空载体,在Th17极化条件下培养4天,结果显示转染IRF8质粒后显著减少IL-17+CD4+T细胞产生(4.20±0.31vs15.42±2.34),差异有统计学意义(p=0.001)。三、IRF8控制Th17细胞的体内分化减轻实验性结肠炎1.转染IRF8-/-较WT小鼠naiveCD4+CD45RBhi T细胞给RAG1KO(RAG1-/-)小鼠,诱导出更为严重的结肠炎,表现在明显的体重下降和更高病理评分和临床评分,差异有统计学意义(p<0.05),且肠系膜淋巴结中IL-17+CD4+细胞比例高,差异有统计学意义(8.07±0.21vs2.44±0.17)(p=0.000),而IFN-y+CD4+细胞比例(6.58±1.05vs5.83±0.31)和Foxp3+CD4+细胞(0.404±0.07vs0.394±0.02)比例两组差异无统计学意义(p>0.05)。2.IRF8-/-和WT小鼠的CD4+CD25+T细胞(Tregs)对转染WT小鼠naiveCD4+T转染给RAG1-/-小鼠诱发结肠炎小鼠的体重影响相似,差异无统计学意义(p>0.05)。结论：①小鼠naiveCD4+T细胞在Th17极化条件下促进了IRF8蛋白的表达,IRF8与RORγt通过蛋白质的直接结合抑制了IL-17的转录与Th17细胞的分化,IRF8和RORγt相互拮抗调控Th17细胞的分化。②转录因子IRF8对Th1、Th2和Tregs分化无影响,B细胞、DC或者巨噬细胞等T细胞以外的细胞不影响IRF8基因对Th17细胞分化的影响。③IRF8控制了Th17细胞的体内分化,IRF8基因敲除的naiveCD4+T细胞免疫介导出更为严重的实验性结肠炎,与IRF8基因沉默促进体内Th17细胞重建有关；IRF8基因敲除的Treg细胞的免疫抑制功能正常。