论文部分内容阅读
背景:胃癌在全球范围内的发病率正逐年增加,是当下因癌症引发死亡的第三大病因。当前,手术被视为根治性治疗手段,但因早期胃癌缺少典型症状,致使早期诊断率低,故大多患者确诊时己属晚期,丧失最佳手术时机。此外,以铂类药物为代表的化疗是胃癌治疗的重要手段,可有效改善胃癌患者的生存期及生活质量;但化疗耐药是不可避免的临床难点,这是胃癌患者治疗和管理需面临的挑战。以免疫检查点阻断疗法为首的免疫治疗的出现为肿瘤治疗带来新的希望,其有效延长黑色素瘤、肺癌等患者生存期并改善预后;而在不同的癌种中,免疫治疗的临床反应率差异极大,限制其在肿瘤治疗中的广泛应用。近年来,PD-L1的表达已被证实是筛选患者响应免疫疗法的重要生物标志。T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域1（TIM1）参与肺癌、脑胶质瘤、宫颈癌、肾透明细胞癌等肿瘤的进程,但TIM1是否参与调控胃癌的生物学行为、影响铂类化疗的敏感性、调节PD-L1的表达仍不清楚。目的:本研究探讨TIM1在胃癌临床样本中的表达及与临床病理特征的相关性,进一步探究TIM1对胃癌的恶性生物学行为（增殖、迁移、侵袭、凋亡及周期等）、铂类化疗的敏感性、PD-L1的表达的影响及潜在调控机制。方法:第一部分:借助GEPIA、TCGA和GEO（GSE62254）查询TIM1在胃癌中的表达及其预后,并以免疫组织化学（IHC）染色检测临床胃癌样本中TIM1的水平,阐述TIM1与临床病理特征的相关性。第二部分:q RT-PCR和Western-blot（WB）检测胃上皮细胞及胃癌细胞系中TIM1的水平;CCK-8及平板克隆形成实验用于评价TIM1对胃癌细胞增殖的影响;细胞划痕及Transwell侵袭实验评价TIM1对胃癌细胞迁移和侵袭的作用;流式周期评价TIM1对胃癌细胞周期的影响;借助裸鼠皮下成瘤模型验证TIM1对体内GC细胞增殖的影响。第三部分:1流式细胞术检测TIM1对胃癌细胞凋亡的影响;流式细胞术及CCK-8检测TIM1调控胃癌细胞对铂类化疗敏感性的影响;WB检测TIM1对胃癌细胞中Bcl-2和Bax蛋白的影响;借助裸鼠化疗敏感性实验体内探究TIM1对铂类制剂敏感性的影响;2 q RT-PCR和流式检测胃上皮细胞、胃癌细胞及裸鼠皮下成瘤中PD-L1的表达;通过胃癌细胞及Jurkat T细胞构建T细胞介导的细胞杀伤试验评价TIM1对T细胞介导的胃癌细胞杀伤能力的影响;乳酸脱氢酶和CCK-8检测TIM1对胃癌细胞的毒性和活力的影响;3行转录组测序及生物信息学分析探讨TIM1对胃癌细胞调控的潜在机制,并进行WB实验验证。结果:第一部分:TIM1在胃癌中的表达和临床意义1访问GEPIA、TCGA和GEO（GSE62254）中胃癌队列,相较癌旁组织（对照组）,胃癌组织中TIM1水平上调,相应的生存曲线均展示TIM1高表达的胃癌患者预后更差,而TIM1低表达的胃癌患者预后较好（p＜0.0001）;2 IHC染色检测胃癌及癌旁组织TIM1的表达,TIM1在胃癌中的阳性率为62.6%（57/91）,而在癌旁组织的阳性率为17.5%（16/91）,有统计学差异（p＜0.05）;胃癌标本中TIM1高表达46例,低表达45例,且TIM1高表达患者的生存预后较低表达者差（p＜0.0001）;3分析TIM1表达与临床病理特征相关性,TIM1表达高低与淋巴结转移（p＜0.001）和TNM分期（p=0.013）相关,与性别、年龄、浸润层次、分化程度、家族史和肿瘤大小无关（p＞0.05）。第二部分:敲低TIM1可抑制胃癌的恶性生物学行为1 q RT-PCR和WB检测发现,与GES-1细胞（胃上皮细胞）相比,胃癌细胞系中TIM1表达均增高;其中,MGC-803和MKN-45细胞中TIM1表达最高,故用于后续实验;2因TIM1在胃癌细胞中高表达,故构建2条敲低TIM1的质粒并命名sh1与sh2,以q RT-PCR和WB评估下调效率;结果为sh1和sh2可有效下调TIM1的m RNA及蛋白表达,即sh1和sh2均具有可靠的敲低效率并可用作后续实验;此外,在敲减效率最明显的sh2上过表达TIM1且命名sh2+TIM1RES用于回复实验,q RT-PCR及WB均显示sh2+TIM1RES可上调TIM1的表达;3与sh NC（对照）组相比,敲低TIM1（sh1和sh2）能有效阻滞MGC-803和MKN-45细胞的增殖、抑制克隆数目和体积、抑制细胞迁移及侵袭能力、增进G1期的细胞占比,而回复TIM1(sh2+TIM1RES)可促进MGC-803和MKN-45细胞的活力、增加克隆形成能力、提升细胞迁移与侵袭、削减G1期的细胞比例;4裸鼠皮下成瘤实验中,和sh NC组相比,敲低TIM1（sh2）组可延缓瘤体生长速率,而回复TIM1(sh2+TIM1RES)组的瘤体生长速率增快;另外,sh2组的瘤体HE和IHC染色数据亦展现细胞坏死减轻、Ki-67（增殖相关标志物）水平下调,而sh2+TIM1RES组细胞坏死程度加剧、Ki-67表达水平增加。第三部分:敲低TIM1促进化疗敏感性、抑制PD-L1的表达及分子机制1 TIM1对铂类化疗敏感性的影响1.1检测MGC-803和MKN-45细胞的凋亡率,发现敲低TIM1（sh1和sh2）促进细胞凋亡,而sh2+TIM1RES可延缓细胞凋亡;其中,MGC-803细胞的sh NC、sh1和sh2组凋亡率各自约为3.0%、9.5%和12.5%,但sh2+TIM1RES组凋亡率降至5.7%;sh NC、sh1及sh2组在MKN-45细胞中的凋亡率约为5.1%、9.9%和13.1%,而sh2+TIM1RES组凋亡率下调至8.0%;1.2检测铂类药物处理MGC-803和MKN-45细胞后的凋亡率,发现各组胃癌细胞凋亡的百分比随药物浓度的递增而上升;其中,sh1组和sh2组的细胞经铂类药物干预后细胞凋亡率增加尤为明显,而sh2+TIM1RES组可减轻经铂类药物导致的凋亡;此外,CCK-8法发现,经铂类药物干预后,各组细胞活性均为浓度依赖性下降,sh1组和sh2组下降最显著,sh2+TIM1RES组可逆转该下降趋势;1.3与sh NC组相比,sh1组和sh2组Bcl-2的表达下降,在sh2+TIM1RES组中Bcl-2的表达量增加;此外,Bax在sh1组和sh2组的水平上升,在sh2+TIM1RES组中Bax水平下调;1.4在裸鼠皮下成瘤实验中,与sh NC组相比,sh2组、顺铂组、奥沙利铂组、联合组1（sh2+顺铂）、联合组2（sh2+奥沙利铂）的瘤体生长均受抑制,其中联合组1和联合组2的下降趋势最为明显。2 TIM1对PD-L1的表达及T细胞介导的胃癌细胞杀伤能力影响2.1 q RT-PCR及流式细胞术数据显示,相较sh NC组,sh1组和sh2组PD-L1的表达被抑制,而sh2+TIM1RES组PD-L1的表达上调;另外,裸鼠皮下瘤体的q RT-PCR及IHC染色结果中,sh2组PD-L1的表达下调,sh2+TIM1RES组PD-L1的表达上升;2.2胃癌细胞和被激活的T细胞共培养后,结晶紫染色发现sh1组和sh2组胃癌细胞存活率较sh NC组明显下降,而sh2+TIM1RES组中细胞存活率增加;乳酸脱氢酶活性检测发现sh1组和sh2组的细胞毒性较sh NC组明显增加,而sh2+TIM1RES组的细胞毒性减弱;CCK-8检测细胞活力得出,相较sh NC组,sh1组和sh2组细胞活力下降明显,sh2+TIM1RES组细胞活力上升,以上趋势均与T细胞数量呈正相关。3 TIM1对胃癌细胞调控的潜在机制3.1转录组测序及生物信息学提示,sh NC VS sh2的差异表达基因有1491个,其中928个基因上调,563个基因下调;KEGG富集分析中前10的信号通路依次为:MAPK信号通路、IL-17信号通路、细胞凋亡、C型凝集素受体信号通路、JAK-STAT信号通路、Fox O信号通路、癌症中的异常转录调控、c AMP信号通路、细胞衰老及Notch信号通路,其中,MAPK信号轴所占比例最大,差异最明显;3.2 WB实验检测MAPK信号轴的关键蛋白,各组间ERK、c-Jun和p38蛋白表达均无明显差异,sh1组和sh2组中p-ERK、p-c-Jun和p-p38的表达较sh NC组均下调,sh2+TIM1RES组中p-ERK、p-c-Jun和p-p38的表达均增加。结论:1 TIM1在胃癌中高表达,其表达与胃癌患者的预后呈负相关;2敲低TIM1可抑制体内和体外胃癌的恶性生物学行为;3敲低TIM1可提升胃癌细胞对铂类化疗的敏感性;4敲低TIM1可抑制PD-L1的表达和增加T细胞介导的胃癌细胞杀伤能力;5 TIM1可能通过MAPK信号通路调控胃癌细胞。