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过去的几十年里,β内酰胺类抗生素的市场需求持续增加,产黄青霉作为β内酰胺类抗生素主要的工业生产菌株,分子改良和过程优化都得到了深入的研究。青霉素工业化大规模发酵过程中,常常会因为传质和混合的限制导致环境梯度(如溶氧、底物、pH梯度等),进而限制了进一步提高青霉素的效价、产率和得率。因此深入了解产黄青霉如何应对不同底物环境梯度,对指导菌株改良和工艺优化具有重要的意义。DeJonge等人在实验室模拟大规模反应器内的底物浓度梯度时,发现高产产黄青霉在应对周期性高、低糖浓度条件下,胞内海藻糖会周期性的合成和降解,形成无效循环,消耗额外ATP,进而影响青霉素合成。鉴于此,本课题主要研究海藻糖途径(部分)缺失对于菌体生长和青霉素合成的影响。本实验采用土壤农杆菌转化法成功构建了海藻糖循环途径tps1、tps2敲除菌株P.chrysogenum-△tps1和P.chrysogenum-△tps2。土壤农杆菌为高毒力的根癌农杆菌AGL-1,载体为pGreenⅡ-0179,筛选标记为博来霉素,实验对象为产黄青霉Wisconsin54-1255孢子。本实验条件下农杆菌的转化效率达到50%,其中发生同源重组的效率达到25%。海藻糖代谢途径的缺失,影响了产黄青霉孢子的形成,在PDA培养基中培养6天后,P.chrysogenum-△tps1只能产生少量孢子,而P.chysogenum-△tps2儿乎无孢子形成。相比于 Wisconsin54-1255,P.chrysogenum-△tps1和P.chrysogenum-△tps2 的菌丝更加透明,但是两种突变菌对葡萄糖的耐受性几乎和出发菌相同,在高糖浓度条件下生长状态与 Wisconsin54-1255 类似。P.chrysogenum-△tps1的比生长速率(μmax)为 0.175 h-1,与 Wisconsin54-1255 类似,基于底物的最大菌体的率YX/sx为2.185 CmolX/molS,是Wisconsin54-1255的0.59倍。在稀释率为0.05 h-1的恒化条件下,胞内海藻糖浓度降低,胞内葡萄糖降低,葡萄糖六磷酸、果糖-6-磷酸和果糖-1,6-二磷酸浓度增加,且恒化过程中qo2达到1.906 mmol/gDW/h,是Wisconsin54-1255的1.1倍,实验结果表明海藻糖六磷酸合成酶的缺失使得菌体代谢活力旺盛,但青霉素最大比生成速率降低至Wisconsin54-1255的一半。P.chrysogenum-△tps2的μmax达到 0.204 h-1,是出发菌的 1.19 倍,但YX/Smax为3.081 CmolX/molS,是Wisconsin54-1255的0.84倍。在稀释率为0.05 h-1的恒化条件下,海藻糖六磷酸积累,浓度达到Wisconsin54-1255的17倍,胞内海藻糖浓度降低为Wisconsin54-1255的0.41倍,糖酵解中间代谢物葡萄糖六磷酸、果糖-6-磷酸和果糖-1,6-二磷酸浓度降低,qo2,qco2为Wisconsin54-1255的0.95倍和0.82倍。实验结果表明敲除海藻糖六磷酸磷酸化酶后,菌体代谢活力降低,但恒化培养过程中青霉素比生速率成随时间一直增加,恒化培养300 h后甚至到达出发菌最大比产物生产速率。