林可霉素是一种林可酰胺类抗生素,在医药领域应用广泛。本课题主要是基于林可链霉菌摇瓶中良好的添加工艺,在15 L发酵罐上进行工艺优化与代谢调控,以期达到提高林可霉素A产量与降低林可霉素B组分含量的目的。本实验以提高林可霉素A产量以及降低林可霉素B组分含量为目标,在单因素实验基础上,利用响应面法对林可链霉菌的含硫前体物质(硫酸钠、甲硫氨酸、半胱氨酸)与磷酸戊糖途径(HMP)的关键前体(葡萄糖酸钙、葡萄糖酸钠)以及相关醇类(肌醇)、离子(氯化钻)等物质进行组合优化。得到最佳优化条件为:氯化钻7.97 mg/L,葡萄糖酸钙6.0 g/L、肌醇0.42 g/L。在15 L发酵罐中进行放大与优化实验,林可霉素A产量可达7705 U/mL,相比对照(5715 U/mL)提高35%,林可霉素B组分含量在90 h达到2.4%,相比对照(4.8%)降低50%,并且在100 h后林可霉素B组分含量维持在5.0%左右低于对照的7.0%,效果十分显著。并探究了钻离子对林可霉素B组分含量的影响。在响应面实验基础上首次以HMP途径中前体物质--葡萄糖酸钙为切入点,在林可霉素发酵过程对其添加浓度与时间进行优化,达到提高林可霉素A产量的目的。在15 L发酵罐中,以林可霉素发酵过程中全料补加时间为基础点,通过间歇与流加技术优化葡萄糖酸钙的添加浓度与时间,得出葡萄糖酸钙的最优补加条件(v=0.0638 g/L/h,t=111-158 h),最终得到林可霉素A最高效价为(9160 U/mL),相比对照(6480 U/mL)提高41.3%,效果显著。在1L发酵罐中,从酶学、代谢物分析以及氧化还原平衡角度研究葡萄糖酸钙对提高林可霉素A产量的机理。其中通过对糖酵解途径、HMP以及三羧酸循环(TCA)关键酶活、其合成前体代谢物以及氧化还原力(NADH、NADPH)的测定发现,在144h,6-磷酸葡萄糖脱氢酶以及异柠檬酸脱氢酶酶活分别是对照的7倍与4倍,同时TCA循环中α-酮戊二酸、琥珀酸、延胡索酸以及苹果酸胞内积累量均不同程度降低,但是HMP途径中林可霉素A合成糖基部分的碳骨架来源均为零,测定NADH与NADPH发现NADPH水平高于对照1.27倍,猜测补加葡萄糖酸钙提高了 HMP、TCA循环的通量,促进菌体消耗葡萄糖,合成更多的前体物质,提供更多的NADPH,进而合成林可霉素A。进一步猜测HMP途径可能是林可霉素合成的限速途径之一。