【摘 要】
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目的:反义技术的发展为研发新一代抗菌药物提供了新思路。本研究以大肠杆菌16S rRNA为药物作用靶标,运用本实验室建立的MAST技术平台筛选其反义核酸作用靶点;通过体外和胞内
【出 处】
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中国人民解放军军事医学科学院 解放军军事医学科学院
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目的:反义技术的发展为研发新一代抗菌药物提供了新思路。本研究以大肠杆菌16S rRNA为药物作用靶标,运用本实验室建立的MAST技术平台筛选其反义核酸作用靶点;通过体外和胞内实验对筛选靶点的有效性进行验证,以期获得能高效结合反义寡核苷酸的靶点序列;根据有效作用靶点合成硫代反义寡核苷酸研究其抑菌效果,为研发新一代核酸抗菌药物进行有益探索。方法:通过在转录16S rRNA过程中引入生物素标记的UTP,将其固定到亲和素磁珠上,保持RNA的自然折叠状态。然后与寡核苷酸文库杂交,筛选能结合的文库序列从而阐明靶点,该方法即为MAST技术(mRNA accessible site tagging)。运用该技术筛选获得16S rRNA6个反义寡核苷酸结合靶点。根据靶点,设计并合成6条靶点特异的反义寡核苷酸和5条10-23型脱氧核酶(DNAenzyme)。采用反义寡核苷酸依赖RNase H切割技术对6条反义寡核苷酸体外对16S rRNA的结合能力进行检测,并采用10-23型脱氧核酶催化切割技术对其中5条脱氧核酶的体外结合切割活性进行检测。经体外验证,所筛6个靶点中5个靶点为16S rRNA可及位点,其中靶点Ⅴ(907-926nt)结合活性最好。然后,构建原核表达载体用IPTG诱导表达单倍体锤头状核酶(sRZ)和双倍体锤头状核酶(dRz),利用表达的核酶胞内特异降解16S rRNA抑制大肠杆菌生长,对靶点Ⅴ胞内有效性进行验证。针对体外和胞内验证有高效结合活性的靶点Ⅴ,合成硫代反义寡核苷酸与通透性好的大肠杆菌SM101温育,检测其对大肠杆菌生长的抑制效果,进行核酸抗菌素的初步研究。结果:运用MAST技术筛选获得位于16S rRNA 179-198、446-465、497-516、887-906、907-926、1236-1255nt6个靶点(Ⅰ-Ⅵ);反义寡核苷酸依赖RNase H切割活性分析结果显示,靶点Ⅱ-Ⅵ为反义寡核苷酸体外高效结合靶点;脱氧核酶催化切割活性分析结果显示,靶点Ⅴ体外活性最为显著;胞内验证结果表明,针对靶点Ⅴ的单倍体和双倍体核酶对大肠杆菌生长均有抑制效果,且双倍体核酶效果更为显著;针对靶点Ⅴ的硫代反
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