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山羊传染性胸膜肺炎（Contagious caprine pleuropneumonia,CCPP）是由山羊支原体山羊肺炎亚种（Mycoplasma capricolum subsp.capripneumoniae,Mccp）引起的一种山羊呼吸道传染病,对山羊养殖业造成了严重危害。世界动物卫生组织（Office International des Epizooties,OIE）将其列为法定报告的动物疫病。目前,疫苗免疫仍然是预防和控制CCPP发生的一个重要手段;然而,Mccp培养时存在营养要求苛刻、生长缓慢和活菌滴度较低等问题,导致灭活疫苗生产成本较高,且生产工艺复杂,严重限制了CCPP疫苗的推广应用;因此,新型疫苗的研制对于该病的防控是非常必要的。前期研究表明,支原体的膜蛋白和表面蛋白与病原的毒力与免疫相关,通常可作为候选抗原应用于支原体亚单位疫苗的研究,但对于Mccp尚未有相关的报道。Mccp M1601株灭活疫苗具有良好的免疫效力,且已详细解析了其全基因组序列。在此基础上,本研究通过利用PSORTb和DNAStar生物信息学软件在全基因组范围内对其编码的713个基因（Genebank accession number:CP017125）,逐个进行分析预测,筛选出CCPP亚单位疫苗候选靶标;进一步,利用原核表达系统表达了多种重组蛋白抗原,制备了多组分亚单位疫苗,并进行了免疫保护效果的研究。详细结果如下:1、通过PSORTb生物信息学软件对Mccp M1601株编码的基因进行亚细胞定位分析,并对其中的膜蛋白和细胞质膜蛋白使用DNAStar软件预测分析,共筛选出15个候选基因,包括p87、p65、p42、p55、p161、PDx FFG、p21、p22,p47、EF-Tu、Tkt A、Dna K、ldh、gapd和m17。其中,PDx FFG编码的蛋白较大,将其分为两段表达。按照大肠杆菌表达系统对上述候选靶标基因序列进行密码子优化,由南京金斯瑞生物科技有限公司合成靶标基因序列并连接到原核表达载体p ET-30a（+）中,构建重组表达质粒;经PCR鉴定、酶切鉴定和基因测序分析,验证构建的重组表达质粒能够用于重组蛋白的表达。2、成功构建了16个重组表达质粒,将重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,经IPTG诱导表达、Ni-NTA亲和层析纯化、透析等过程,共获得12个重组蛋白,分别为rP87、rP42、rP55、rP161、rPDx FFG-C、rPDx FFG-N、rEF-Tu、rTkt A、rDna K、rLDH、rGAPD和rM17。利用Western Blot验证Mccp感染的山羊血清和全菌抗原高免兔血清与12个重组蛋白的反应性,结果显示Mccp感染山羊血清和全菌高免兔血清与rP87、rP42、rP55、rP161、rPDx FFG-N、rEF-Tu、rTkt A、rDna K、rLDH、rGAPD和rM17 11个重组蛋白均具有良好的反应性;Mccp感染的山羊血清与rPDx FFG-C蛋白反应能够检测到清晰的特异性条带,而全菌高免兔血清与rPDx FFG-C反应未检测到特异性条带;表明PDx FFG-C是Mccp活菌中存在的蛋白,能够刺激机体产生抗体,而灭活的Mccp中该蛋白不能刺激机体产生抗体。3、将制备的12个重组蛋白分别免疫新西兰大白兔,获得相应的多克隆抗体血清,经Western blot检测验证多克隆抗体的反应性和特异性。结果显示抗rP87、rP55、rEF-Tu、rTkt A、rDna K、rLDH、rGAPD和rM17 8个重组蛋白的多克隆抗体具有良好的反应性和特异性;抗rP161和rPDx EFG-C 2个重组蛋白的多克隆抗体反应性良好,而特异性较差;抗rPDx EFG-N和rP42 2个重组蛋白的多克隆抗体反应性良好。利用多克隆抗体与M1601膜蛋白的反应,验证了P87、P55、P161、PDx FFG、EF-Tu、Tkt A、Dna K、LDH、GAPD和M17 10个蛋白均定位于细胞膜。4、根据上述实验结果筛选出rP87、rP55、rP161、rPDx FFG、rEF-Tu、rTkt A、rDna K、rLDH、rGAPD和rM17 10个重组蛋白做为CCPP亚单位疫苗的候选靶标。将其随机分为3组制备多组分亚单位疫苗,免疫8～9月龄健康山羊,同时设置灭活疫苗免疫组、攻毒对照组、空白对照组进行免疫保护试验,结果显示,亚单位疫苗2组（抗原:rLDH、rM17、rEF-Tu和rTkt A）的存活率为100%,明显高于攻毒对照组的40%,也高于全菌灭活疫苗组的80%。亚单位疫苗1组（抗原:rP55、rP161、rPDx FFG-C、rPDx FFG-N）和3组（抗原:rDna K、rGAPD、rP87、rM17）的存活率分别为60%和33%。根据剖检的肺部病理变化和载菌量来看,亚单位疫苗2组比攻毒对照组的病理变化明显减轻,并能够有效降低Mccp在肺脏和肺泡灌洗液中的定植量。上述结果为后续进行更详细的免疫保护机制研究和CCPP亚单位疫苗的制备奠定了基础。