目的:根据《中国药典》,马尾藻科植物羊栖菜Sargassum fusiforme（Harv.）Setch.的干燥藻体,习称“小叶海藻”,为我国药典收录的海藻常用品种之一,是我国的特色海藻,资源十分丰富,民间常作为药食两用的植物使用,在我国药用历史十分悠久,亦为中医临床常用中药;小叶海藻做为药食两用的药材,市场流通中品种混乱,现行药典中小叶海藻质量标准制定比较简单,如缺乏切片、粉末显微特征和水溶性浸出物等内容,市售小叶海藻药材质量参差不齐,严重制约了小叶海藻的进一步开发和利用,因此,本文以《中国药典》（2015）为依据,同时开展小叶海藻中多糖提取工艺和含量分析研究,评价并补充小叶海藻药材质量标准;开展多糖部位的制备纯化及其对急性酒精性肝损伤小鼠保护作用的研究,希望通过研究,可为小叶海藻药材和饮片标准化、资源综合利用提供实验依据。方法:1小叶海藻药材质量评价研究采用热浸法、超声法提取小叶海藻中多糖。以蒸馏水为提取剂,考察固液比、提取温度、提取时间、提取次数、超声功率等单因素的影响;开展均匀设计实验,优化热浸法和超声法提取工艺并比较两种方法提取工艺中多糖的得率。参照《中国药典》（2015）,对22批小叶海藻药材的[性状]、[鉴别]、[检查]、[浸出物]、[含量测定]等内容进行质量评价,其中新增鲜品小叶海藻药材性状,药材横切面、粉末特征的显微鉴定,及总灰分、酸不溶性灰分、水溶性浸出物测定等研究内容。2小叶海藻中粗多糖制备及其对小鼠急性酒精性肝损伤的保护作用研究采用最佳提取方法与最优工艺提取小叶海藻中粗多糖,水提醇沉纯化,做为动物实验用药。60只Balb/c小鼠随机分成空白组、模型组、海藻粗多糖低剂量组、海藻粗多糖中剂量组、海藻粗多糖高剂量组和联苯双酯对照组。各组实验动物给药体积为10 mL/（kg·d）,给药11天,空白组与模型组给予生理盐水,海藻粗多糖低、中、高剂量组给药分别为25、50、100 mg/kg,联苯双酯对照组为150 mg/kg。末次给药4h后,空白组灌胃14 mL/kg的生理盐水,其余各组均采用50%乙醇以14 mL/kg的剂量一次灌胃建立急性酒精肝损伤模型。造模后14h采集小鼠粪便,测量小鼠肠道菌群;16 h后取血,分离血清,备用测定ALT、AST含量;取血后断颈处死小鼠,取出完整肝脏,称重,计算肝脏指数;取部分肝组织常温下保存在4%多聚甲醛溶液中,用于制作石蜡切片,进行肝组织的病理学检查;另一部分肝组织制作肝匀浆,用于SOD、MDA、GSH、TG等指标检测。结果:1小叶海藻药材质量评价研究1.1小叶海藻中多糖提取研究单因素考察实验结果显示,热浸法提取最适提取条件为:固液比为1:40、提取温度100℃、提取时间3 h、提取3次;超声法最适提取条件为:固液比为1:40、超声温度60℃、超声时间30 min、超声功率300 W、超声3次。均匀设计法优化工艺显示,热浸法最佳工艺为:固液比为1:50、提取温度100℃、提取时间为3 h;超声法最佳工艺为:固液比为1:60、提取温度75℃、提取时间60 min、超声功率为450 W。热浸法与超声法多糖得率分别为5.30±0.08%、4.27±0.05%,因此,确定热浸法为最佳方法。1.2[性状]小叶海藻鲜品:黄褐色,长15～50 cm,有的可达2 m以上,肉质肥厚多汁,粘性,触感光滑,易断。主干呈圆柱状,四周互生侧枝和叶状突出,无刺突。叶状体,形状多变,易掉落。气囊中部膨大、中空、顶端尖。气腥,味咸。小叶海藻干品:黑褐色,皱缩卷曲,有的被白霜,长15～40 cm,质较硬。主干呈圆柱状,顶部主枝光滑,主枝自主干两侧生出,侧枝自主枝叶腋生,分枝互生,无刺突状突起。叶状体条形或细匙形,先端稍膨大,中空。气囊腋生,纺锤形或球形,囊柄长。水浸后膨胀,肉质,黏滑。气腥,味微咸。1.3[鉴别]1.3.1横切面显微主干横切面:类圆形,边缘波浪状弯曲,可见类表皮细胞、类皮层细胞、类髓部等特征;最外侧为一列类表皮细胞,径向紧密排列;类皮层细胞排列疏松约占2/3;类髓部细胞排列紧密,约占1/3。叶状体横切面:椭圆形,边缘凹凸不平,无类似叶脉状结构。类表皮细胞一列狭长径向紧密排列。接近表皮的一列细胞为类圆形,含有色物质。类皮层由不规则多角形的薄壁细胞组成,排列疏松约占5/6。类髓部由近圆形的厚壁细胞组成,内含载色体,约占1/6。气囊横切面:呈圆环状,气囊为中空结构,其横切面无类髓部结构。外层为类表皮细胞,外壁胶质化,内含大量载色体,排列紧密。类表皮细胞由不规则多角状薄壁细胞组成。内层可见颓废细胞碎片。1.3.2粉末显微:黑褐色,常见棕色块,呈不规则形状。纤维较多,细长,顶端圆钝或如针尖,大小不一。有淀粉粒。1.3.3理化鉴别:小叶海藻冷浸溶液加入三氯化铁试液后,22批次小叶海藻药材均有棕色沉淀出现。1.4[检查]和[浸出物]22批小叶海藻药材水分含量范围为9.04±0.04%～16.74±1.45%,平均水分含量为12.60%;总灰分含量范围在14.76±0.49%～33.92±0.15%,平均含量为21.06%;小叶海藻酸不溶性灰分含量范围在0.05±0.02%～0.74±0.08%,平均含量为0.32%;水溶性浸出物含量在36.92±0.13%～63.47±0.93%,平均含量为46.06%;醇溶性浸出物含量范围在3.89±0.09%～18.73±0.10%,平均含量为10.72%。1.5[含量测定]22批小叶海藻药材中多糖含量范围为4.44±0.28～9.67±0.22%,平均含量为6.53%。2小叶海藻中粗多糖制备及其对小鼠急性酒精性肝损伤保护作用研究经过3次纯化的多糖以L-岩藻糖计含量为17.54±1.77%,以3次纯化后的多糖为实验药物。各组实验动物体重显示:小鼠空白组体重为25.49±1.65、模型组为25.83±0.65、海藻粗多糖低剂量组为25.88±1.70、中剂量组为25.83±1.43、高剂量组为25.49±2.83、联苯双酯组为25.91±0.83 g。空白组与模型组相比,两组无显著性差异（P>0.05）;给药组与模型组相比均无显著性差异（P>0.05）,说明给予酒精和药物对小鼠体重没有影响。各组实验动物肝脏指数显示:小鼠空白组为4.33±0.49、模型组为5.01±0.69、海藻粗多糖低剂量组为5.51±1.81、中剂量组为4.96±0.55、高剂量组为5.24± 1.02、联苯双酯组为5.19±0.22%。模型组与空白组相比,模型组小鼠肝脏指数明显升高,具有显著性差异（P<0.05）,提示造模过程引起了小鼠肝脏肿大;给药组与模型组相比均无显著性差异（P>0.05）,说明小叶海藻粗多糖及联苯双酯对急性酒精性肝损伤动物模型肝脏肿大改善作用不明显。病理切片结果显示:空白组小鼠肝细胞呈放射状整齐排列在中央静脉周围,肝组织结构完整,肝小叶结构清晰,肝细胞排列整齐,未见肝细胞坏死和炎性细胞浸润现象。模型组可见肝细胞明显水样变、脂肪样变,部分可见肝细胞体积变大,胞浆内可见脂肪空泡,大小不等,肝索排列紊乱,可见炎性细胞浸润。海藻粗多糖低剂量组与模型组相似;海藻粗多糖中剂量组和高剂量组较模型组有改善,发现肝细胞索趋于正常,浸润现象减弱。联苯双酯组较模型组稍有改善。血清中ALT、AST测定结果显示:ALT含量分别为:空白组为44.15±7.05、模型组为70.80±3.89、海藻粗多糖低剂量组为65.56±2.40、中剂量组为59.01±5.88、高剂量组为53.49±5.71、联苯双酯组为52.39±5.73卡门氏单位。AST含量分别为:空白组为52.53±13.13、模型组为95.72±9.63、海藻粗多糖低剂量组为70.75±13.10、中剂量组为56.50±8.10、高剂量组为53.17±4.53、联苯双酯组为55.42±7.79卡门氏单位。模型组同空白组相比,模型组ALT、AST水平均显著升高（P<0.01）,模型组转氨酶升高,提示肝损伤造模成功,造模方法可行。各给药组的ALT、AST与模型组相比明显下降,均具有显著性差异（P<0.01）,表明海藻粗多糖能有效降低酒精所引起的ALT、AST水平的升高,发挥对酒精性肝损伤的保护作用。各组实验动物MDA检测结果显示:空白组为1.39±0.18、模型组为2.01±0.59、海藻粗多糖低剂量组为1.66±075、中剂量组为0.92±0.84、高剂量组为0.82±31、联苯双酯组为0.61±0.33 nmol/mgprot。模型组与空白组相比,模型组MDA显著性升高（P<0.05）,模型小鼠中脂质过氧化反应最终代谢MDA升高,反应过氧化损伤和肝细胞损伤的程度加深,MDA浓度的增加会改变细胞膜通透性,引起细胞肿胀,坏死;各给药组与模型组相比,中、高剂量及联苯双酯组MDA活性均显著下降（P<0.05）,说明海藻粗多糖中、高剂量组可显著降低机体MDA水平,增强机体对氧自由基的清除,提示海藻粗多糖在抗氧化方面发挥了作用。SOD检测结果显示:空白组为75.48±12.93、模型组为60.38±7.37、海藻粗多糖低剂量组为78.54±4.33、中剂量组为80.59±9.69、高剂量组为85.86±24.54、联苯双酯组为72.08± 11.66 U/mgprot。与空白组相比,模型组SOD显著性下降（P<0.05）,说明酒精抑制SOD活性,肝损伤的程度增加;给药组与模型组相比SOD水平显著上升（P<0.05）,证实海藻粗多糖能显著提高机体SOD活性,增强自由基清除能力,减轻酒精对小鼠肝脏的损害作用。各组实验动物GSH检测结果显示:空白组为69.78±14.20、模型组为54.44±10.62、海藻粗多糖低剂量组为68.38±8.36、中剂量组为68.57±12.94、高剂量组为70.31±8.70、联苯双酯组为65.66±8.42 μmol/gprot。模型组与空白组相比,模型组GSH水平明显下降,具有显著性差异（P<0.05）说明肝内GSH被消耗;给药组与模型组相比有所上升,具有显著性差异（P<0.05）,说明能海藻粗多糖能有效抑制GSH的消耗,防止肝细胞损伤。各组实验动物TG显示:空白组为0.11±0.02、模型组为0.18±0.03、海藻粗多糖低剂量组为0.22±0.04、中剂量组为0.11 ±0.03、高剂量组为0.09±0.02、联苯双酯组为0.09±0.03 mmol/L。模型组与空白组相比,TG水平显著升高（P<0.05）,说明给予酒精后,肝脏脂代谢异常,脂肪在肝细胞中大量堆积;海藻粗多糖中、高剂量组和联苯双酯组与模型组相比,TG水平显著性下降（P<0.05）,证明海藻粗多糖能降低酒精肝小鼠中TG含量,改善肝脏脂肪变性,维持甘油三酯的正常合成排泌功能。肠道菌群检测中,稀释曲线和等级丰度曲线结果表明,每个样本的菌群物种已基本全部覆盖。Shannon指数中与空白组相比,模型组Shannon指数略微降低,但无显著性差异（P>0.05）,说明研究引起了菌群物种的变化,变化的量还不明显。因酒精和海藻粗多糖影响而使菌落结构和组成发生改变的有9个细菌门,从高到低依次是拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门、放线菌门、Epsilonbacteraeota、patescibacteria、脱铁杆菌门、软壁菌门和蓝藻门。通过对门水平物种比较分析各组小鼠肠道菌群丰度变化,发现小鼠粪便样品67.95%以上都是由拟杆菌门和厚壁菌门组成。且同空白组比较,模型组小鼠肠道菌群中的拟杆菌门和厚壁菌门丰度降低,证实酒精摄入能使小鼠肠道菌群组成结构发生改变;同模型组相比,海藻粗多糖低、中、高剂量组和联苯双酯组小鼠肠道菌群中的拟杆菌门丰度升高,菌群组成向空白组小鼠的肠道菌群组成恢复,表明海藻粗多糖具有调节小鼠肠道菌群的作用。结论:1小叶海藻药材质量评价研究小叶海藻中多糖的提取宜采用热浸法,热浸法提取最适提取条件为:固液比为1:40、提取温度100℃、提取时间3 h、提取3次。22批小叶海藻药材基本符合《中国药典》（2015）要求。同时较《中国药典》（2015）增加了小叶海藻药材横切片特征、粉末特征、水溶性浸出物、总灰分及酸不溶性灰分等内容项。初步拟定小叶海藻药材的总灰分不得过41%;酸不溶性灰分不得过0.89%,水溶性浸出物（热浸法）不得少于18.5%。2小叶海藻中粗多糖对小鼠急性肝损伤的保护作用研究小叶海藻粗多糖制备宜采用水提醇沉方法进行提取及初步纯化。小叶海藻粗多糖可以从减轻肝脏组织病变、抗脂质过氧化、提高脂类代谢功能及调节肠道菌群等多方面发挥对急性酒精性肝损伤的保护作用。