牡蛎为牡蛎科动物长牡蛎(Ostrea gigas Thunberg)、大连湾牡蛎(Ostrea talienwhanensis Crosse)或近江牡蛎(Ostrea rivuLaris GouLd的贝壳,是历版《中国药典》收载的中医临床常用药,味咸,微寒。归肝、胆、肾经。生牡蛎重镇安神,潜阳补阴,软坚散结。牡蛎壳含碳酸钙90%以上,有机基质由不同大分子组成,主要为蛋白质和多糖。目前对于牡蛎主要药理作用研究包括牡蛎镇静、抑制自发活动及安眠作用。目前国内外对于牡蛎药效仅是整体研究,特别是有机质成分及其药理作用,尚未见报道。牡蛎临床配伍常用葛根进行降血压治疗,而葛根主要药效物质成分明确、药理作用及机制成熟,本课题就选取牡蛎配伍葛根研究其药效物质基础。课题对于贝壳类海洋药的开发利用以及中药科学化发展有重要意义。本文对牡蛎基本化学成分进行了分析,对无机质成分采用X射线衍射的方法建立了药材指纹图谱,对有机质成分通过离子交换层析、反向C8柱层析的方法进行分离,得到寡肽类成分。对牡蛎药效物质基础分部位进行了镇静药理作用考察。接着对牡蛎配伍葛根药效物质基础进行了研究,包括配伍前后理化性质的变化、葛根对牡蛎钙的溶出作用、牡蛎对葛根药效物质的溶出作用等。对牡蛎配伍葛根药理作用及机制进行了探讨,包括镇静作用和降血压作用。最后建立液质联用的方法对牡蛎配伍葛根前后葛根素在大鼠体内的药代动力学进行了研究,并采用光谱学和分子对接手段对葛根素与药物代谢酶和转运蛋白的体外相互作用进行了探讨。第一部分是文献研究。查阅国内外相关文献,对牡蛎的研究概况、葛根的研究概况、中药复方配伍药效物质基础研究进展进行了综述,为本课题的研究提供思路和方法。第二部分对牡蛎化学成分进行了研究。采用差热分析、红外光谱和X射线衍射的方法建立指纹图谱分析了无机质组成,主成分是碳酸钙(CaCO3),升高温度会逐步分解变成氧化钙(CaO),牡蛎药材XRD指纹图谱具有较好的专属性;对牡蛎壳有机质进行研究,采用双缩脲法进行了总肽的定性和定量分析,表明为寡肽,总肽含量为38.02%,采用苯酚-硫酸法分析了总糖含量,进行了有机质的氨基酸组成分析;通过离子交换层析对有机质进行了初步分离提纯,并通过质谱分析进行了分子量分布范围分析,表明分子量在1000以下;进一步进行了反向C8柱层析得到寡肽,采用液质联用分析了纯度,最后对纯化的寡肽进行了抗氧化性研究,表明具有很好的抗氧化性能,清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基、超氧阴离子自由基的能力呈现量效关系。第三部分对牡蛎的镇静药理作用进行了研究。本部分考察了牡蛎、CaCO3以及牡蛎有机质对戊巴比妥钠诱导的小鼠睡眠时间的影响,探讨了其镇静的物质基础。结果表明,牡蛎单剂量给药不显示镇静作用,而连续给药则显示出明显的镇静作用,并呈现量效关系。提示牡蛎的镇静作用具有叠加性,作用途径和机制与安定不同。CaCO3化学药品呈现生牡蛎一样的镇静作用,而牡蛎有机质部分协同戊巴比妥钠的睡眠作用与其他牡蛎制备液相比为弱,提示牡蛎的镇静作用与CaCO3主要相关。进一步采用western blot方法检测单胺类兴奋性神经递质5-羟色胺受体(5-HTR)和氨基酸类抑制性神经递质Y-氨基丁酸受体(GABAR)的表达情况。结果表明,CaCO3组、生牡蛎混悬液组、生牡蛎有机质组及水不溶性组的小鼠脑组织中5-HTR的表达均不同程度地下调,而GABAR的表达均不同程度地上调,提示生牡蛎不同制备液及CaCO3化学药品的镇静作用与对神经中枢的兴奋性神经递质转导的抑制与对抑制性神经递质转导的增强有关。第四部分研究了牡蛎配伍葛根的药效物质基础。首先研究了牡蛎配伍葛根对水提液电导率、盐度、黏度、浊度、pH的影响,结果表明配伍后随着牡蛎比例增大,水提液电导率、盐度、黏度和浊度均减小,同时pH增大。理化参数中浊度和黏度的变化显示,牡蛎与葛根配伍可使得其不溶性成分大量溶解对促进药物的吸收大有益处。电导率与盐度的变化显示,葛根中的黄酮类化合物等可能是与牡蛎溶出的Ca离子形成络合物的形式发挥作用。然后研究了葛根对牡蛎Ca的溶出作用,随着药对中葛根比例增大,Ca含量增大,即葛根促进了牡蛎Ca的溶出;同时发现,以化学药品CaCO3替代牡蛎,在相同比例条件下,Ca含量会下降,说明牡蛎不可用化学药品CaCO3替代。水提液中可溶性Ca是以多种形态共存的复杂平衡体系,大多以离子态和无机态形式存在,也有少量的有机结合态。最后研究了牡蛎对葛根药效物质溶出的影响,结果表明牡蛎对葛根主要药效成分葛根素和葛根总黄酮的溶出有明显的作用。另外,相同条件下以CaCO3代替牡蛎,对葛根素和葛根总黄酮的溶出效果比牡蛎弱,说明说明牡蛎不可用化学药品CaCO3替代。第五部分对牡蛎配伍葛根的药理作用进行了研究。首先是镇静作用,考察了牡蛎、葛根、牡蛎与葛根配伍不同剂量对戊巴比妥钠诱导的小鼠睡眠时间的影响,结果表明配伍组比牡蛎组镇静作用加强,且配伍高剂量组作用更明显。进一步以western blot方法检测脑组织中5-HT受体和GABA受体的表达情况,结果显示,牡蛎组、葛根组及二者配伍组均可不同程度地降低小鼠脑内5-HTR的表达并升高GABAR的表达,提示牡蛎配伍葛根能够更为明显地调控小鼠脑内神经递质受体的表达,从而产生配伍增效的作用。然后是降血压作用,以自发性高血压大鼠为模型,研究了牡蛎、葛根、牡蛎与葛根配伍不同剂量对模型动物血压、血清Ca、血管平滑肌胞内Ca、一氧化氮、内皮素、心钠素、肾素、血管紧张素Ⅱ、醛固酮、血液流变学等指标以及左心室的影响,结果表明两药及其配伍对这些指标均有调控作用,这些作用与其抗高血压作用密切相关。第六部分对牡蛎配伍葛根后葛根素在大鼠体内的药代动力学进行了研究,建立了液质联用的方法,采用电喷雾离子源,检测方式为负离子,多离子反应监测模式,以芦丁作为内标,通过DAS 2.0软件进行药代动力学数据处理,得到了牡蛎配伍前后葛根素的药时曲线。结果表明,配伍后药时曲线下面积大,峰浓度高,说明在牡蛎的协同作用下,葛根素吸收进入大鼠血液循环的相对数量大,吸收速度快;灌胃药对水提液后表观分布容积大,说明在牡蛎的协同作用下,葛根素更多地分布在组织中,与组织或蛋白有特殊的亲和力;灌胃药对水提液后半衰期大,平均滞留时间长,说明在牡蛎的协同作用下,葛根素消除较慢。牡蛎对于葛根药效成分的代谢影响较大,有助于葛根素的吸收和分布,第七部分研究了葛根素与药物代谢酶(细胞色素P450)和转运蛋白(人血清白蛋白)的体外相互作用,并研究了 Ca离子的影响。采用荧光光谱、紫外光谱、圆二色谱分析方法研究了葛根素与细胞色素CYP1A2和CYP2D6的相互作用,同时采用Autodock软件进行了分子对接研究,结果表明葛根素对CYP1A2和CYP2D6的猝灭机制均为静态猝灭,主要结合作用力为疏水作用力和氢键,葛根素能使CYPs的构象发生变化,Ca离子能够使葛根素与CYPs的结合能力更强;采用荧光光谱、紫外光谱、核磁共振的分析方法研究了葛根素与人血清白蛋白(HSA)的相互作用。结果表明葛根素对HSA的猝灭机制为静态猝灭,主要结合作用力为疏水作用力和氢键,葛根素能使HSA的构象发生变化,Ca离子能够使葛根素与HSA的结合能力更强。这些研究结果与上一章药代动力学的结果彼此相互印证,相辅相成。综上所述,牡蛎药效物质基础以CaCO3为主,但是化学药品CaCO3不能够完全代替牡蛎的作用,牡蛎配伍葛根对药效物质的溶出有促进作用,配伍后镇静和降血压药理作用均增强,本课题对贝壳类中药与植物药配伍增效的化学与药理机制研究作出了探索。