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睾丸是对化疗药物高度敏感的器官,化疗后出现不同程度睾丸功能损伤的患者越来越多,严重影响男性生殖健康。吡柔比星(pirarubicin,THP)是血液系统及泌尿系统恶性肿瘤[1,2]治疗常用的化疗药。针对体内异常增殖的肿瘤细胞,THP能够造成细胞DNA损伤,诱导肿瘤细胞凋亡。然而,体内分裂活跃的细胞,如生殖细胞,对于化疗药物表现出高度敏感性。锌指蛋白146(Ring finger protein,RNF146)是一种新近发现的具有E3泛素连接酶活性的DNA损伤反应蛋白[3]。预实验中我们发现其在成年雄性小鼠睾丸组织中高表达。RNF146在新生小鼠睾丸组织中表达极低,随着性发育表达水平迅速升高。这一现象引起了我们的重视,然而仍有一些问题需要深入探索。RNF146在成年小鼠睾丸精原细胞中高表达的意义是什么?小鼠化疗后精原细胞的DNA损伤与RNF146之间存在联系吗?RNF146能否作为化疗后改善精原细胞DNA损伤的靶点呢?为此,我们进行了下列两部分研究工作:第一部分RNF146在小鼠睾丸组织中的表达及定位特点目的:明确DNA损伤反应蛋白RNF146在小鼠睾丸组织中的表达规律及细胞定位特点。方法:取成年雄性C57小鼠8只,分别提取包括睾丸在内的主要组织器官总蛋白,通过Western-blot实验评价RNF146表达的组织特异性。取新生、7日龄、1月龄、3月龄和1年龄雄性C57小鼠各5只,提取一侧睾丸组织总蛋白,经Western-blot观察C57小鼠睾丸组织中RNF146的表达规律,另一侧睾丸组织制备石蜡切片。通过HE染色、免疫组化和免疫荧光染色明确小鼠睾丸组织中RNF146与生精细胞发育的关系及成年小鼠睾丸曲精小管中RNF146细胞定位特点。结果:Western-blot结果提示在成年雄性C57小鼠全身各脏器中,RNF146主要表达于肺、睾丸、脑和脾等脏器中,肝、肾及胃中表达水平极低;随着小鼠的性发育,睾丸组织中RNF146表达水平迅速升高,老年鼠睾丸组织中RNF146表达降低。免疫组化和免疫荧光染色提示成年雄性小鼠睾丸组织中RNF146主要定位在曲精小管精原细胞上,间质血管及支持细胞几乎不表达。结论:RNF146在正常成年雄性C57小鼠各器官中表达具有组织特异性,肺、睾丸及脑是其主要表达脏器。睾丸中RNF146的表达水平随小鼠性发育迅速升高,老年阶段降低。成年小鼠睾丸组织中RNF146主要定位在曲精小管的精原细胞区域,提示其可能与精原细胞的功能有关。第二部分RNF146对吡柔比星引起的小鼠睾丸精原细胞DNA损伤的保护作用目的本实验以小鼠睾丸精原细胞株GC-1为细胞模型,通过包装RNF146过表达慢病毒及对照病毒,感染GC-1细胞,采用吡柔比星干预的方法复制精原细胞DNA损伤模型。观察基因rnf146是否对化疗药吡柔比星干预所引起的精原细胞株GC-1 DNA损伤具有保护作用。方法以小鼠睾丸组织总RNA为模板反转录合成c DNA,设计引物PCR扩增rnf146片段,将片段与载体p CDH连接以构建p CDH-rnf146重组质粒,以Lipofectamine?3000为介质将重组质粒p CDH-rnf146、载体对照质粒p CDH-egfp以及包装质粒ps PAX2、p MD2.G共转H E K293T细胞包装病毒。以小鼠睾丸精原细胞株GC-1为观察对象,设置Blank、Lenti-EGFP及Lenti-RNF146三组GC-1细胞,采用L enti-RN F146过表达慢病毒感染的方法复制RNF146过表达的GC-1细胞模型,无关病毒Lenti-EGFP感染组为平行对照,通过Western blot鉴定Lenti-RNF146在GC-1细胞中的过表达效率。采用吡柔比星处理的方法复制GC-1细胞的DNA损伤模型,Brd U掺入标记实验评价吡柔比星对GC-1细胞增殖的影响并确定最佳干预浓度,彗星实验评价吡柔比星对GC-1细胞DNA完整性的影响,Tunel染色分析吡柔比星对GC-1细胞凋亡的影响。在吡柔比星干预的GC-1、L enti-EG FP/GC-1和Lenti-RNF146/GC-1三种细胞模型中,通过彗星实验、T UN EL染色分析RNF146对吡柔比星引起的GC-1细胞增殖抑制、凋亡增多及D NA损伤的保护作用。结果成功构建了小鼠p CDH-rnf146重组质粒并包装得到了RNF146过表达慢病毒,Western blot结果提示Lenti-RNF146过表达慢病毒能够显著上调GC-1细胞中RNF146的表达效率。1.0μg/m L为吡柔比星干预GC-1细胞的最佳处理浓度。Brd U掺入标记显示RNF146能够减轻吡柔比星引起的GC-1细胞增殖抑制。TUNEL染色提示RNF146能够缓解吡柔比星诱导的GC-1细胞凋亡。彗星实验显示RNF146过表达能够有效保护吡柔比星作用下GC-1细胞DNA的完整性。结论RNF146对化疗药吡柔比星引起的小鼠睾丸精原细胞损伤具有保护作用。