根据科学家们在全球范围对肺癌进行的调查显示,这些年肺癌的发病率呈持续上升的趋势,而这个趋势在我国特别突出。据统计,每一年我国有超65万同胞因为肺癌而死。目前,肺癌的临床医治方案针对不同的类型有所差别,小细胞肺癌(SCLC)对放疗和化疗敏感,而非小细胞肺癌(NSCLC)则以手术为主。在化疗方面,传统的细胞毒类抗癌药物在杀伤肿瘤细胞的同时,也对肝肾和造血系统等器官产生不可逆的毒性和损伤作用,产生极为严重的毒副作用。为了解决这一现状,本课题在前期确认莪术醇具有抗肺癌药效学作用的工作基础上,拟进一步对莪术中另一个含量较高的化合物莪术烯的抗肿瘤作用及其机制进行研究。同时,设计合成具有肺癌靶向性的ZT-21,然后对它的抗肺癌活性及机制进行研究。目标在于阐明莪术烯的成药性,同时确认ZT-21是否具有高效低毒的抗肺癌效应。本论文主要分为两章:第一章:围绕中药单体化合物莪术烯的抗肺癌药效学展开研究,阐明其抗肿瘤效应,如出现阳性反应则对其抗肿瘤作用机制进行研究;第二章:根据课题组前期的分子影像学研究确认的精氨酸在肺癌组织中靶向性分布聚集效应显著的结果,拟以精氨酸为靶向载体,通过与草酰氯单乙酯耦联合成获得三羧酸关键代谢质草酰乙酸的类似物ZT-21,以获得靶向性抗肿瘤代谢从而产生抗肺癌效应,对其体内外抗肺癌药效学、药物最大耐受量等成药性指标进行了评价。第一章本章围绕中药单体莪术烯的抗肺癌药效学及其机制进行研究,以初步明确莪术烯是否为先导抗癌化合物。本章共分为六节。第一节采用MTT法研究了莪术烯对正常成纤维细胞MRC-5细胞及非小细胞肺癌SPC-A1细胞增殖的影响。实验结果显示:不同浓度的莪术烯(6.25,12.5,25,50,100μM·L-1)处理SPC-A1细胞后,其生长状况都受到莪术烯不同程度的抑制影响,其抑制作用呈时间依赖性和浓度依赖性,通过SPSS V.11统计分析,结果表明,莪术烯处理SPC-A1细胞24小时,48小时,72小时后的IC50值分别为403.8μM·L-1、154.8μm·l-1、47.01μm·l-1。而莪术烯对mrc-5细胞的生长无显著抑制作用。本结果提示,莪术烯对非小细胞肺癌spc-a1细胞具有选择性抑制作用,同时也表明莪术烯具有较高的安全性。第二节采用hoechst33258染色法观察不同浓度的莪术烯(6.25,12.5,25,50,100μm·l-1)处理后spc-a1细胞的形态学变化。实验结果显示:在荧光倒置显微镜下观察,与空白对照组相比,不同剂量的莪术烯分别处理spc-a1细胞后,肿瘤细胞出现典型的细胞凋亡形态学改变,存活的细胞减少,凋亡细胞的细胞核收缩,一些细胞核破碎成块,且着色较深,并呈现较亮的蓝色,并且随着莪术烯给药剂量的增加,spc-a1细胞数量减少,凋亡小体比例增加。本实验结果提示,在一定剂量范围内莪术烯对spc-a1细胞具有诱导凋亡作用。第三节采用流式细胞术通过fitc-annexinv/pi双标记染色法检测莪术烯对spc-a1细胞凋亡率的影响。实验结果发现,莪术烯作用于spc-a1细胞48h后,凋亡细胞均明显多于空白对照组,并且凋亡细胞数目随莪术烯的浓度增高而增加,呈现浓度依赖性,不同浓度的莪术烯(6.25,12.5,25,50,100μm·l-1)总凋亡率分别为7.00%、17.43%、38.52%、58.21%、72.85%,该结果与mtt实验结果基本一致,提示大剂量莪术烯可以明显杀伤spc-a1细胞,小剂量莪术烯可以诱导spc-a1细胞凋亡。第四节采用流式细胞术检测莪术烯对细胞周期的影响。实验结果显示,对照组峰形为典型肿瘤细胞的峰形,与对照组相比,随着莪术烯浓度的升高,细胞g2/m期比例增大,表现出一定的浓度依赖性,但s期、g0/g1期并没有呈现一定的剂量关系。提示莪术烯是将spc-a1细胞阻滞在g2/m期,以抑制细胞有丝分裂的进行,进而达到抑制spc-a1细胞增殖的目的。第五节采用real-timepcr和westernblot检测莪术烯对spc-a1细胞gsta1表达的影响。实验结果显示:莪术烯处理后spc-a1细胞的gsta1基因和蛋白质表达量下调,且莪术烯浓度越高,gsta1基因和蛋白质表达量越低。第六节建立裸鼠皮下移植瘤模型,以肿瘤的重量抑制率为药效学评价指标,检测莪术烯对荷瘤裸鼠肿瘤生长的抑制作用。将荷瘤裸鼠随机分成5组(模型组、阳性对照组(β-榄香烯组,135mg·kg-1·d-1)、莪术烯高剂量组(135mg·kg-1·d-1)、中剂量组(45mg·kg-1·d-1)、低剂量组(15mg·kg-1·d-1)),6只每组,雌雄各一半,采用腹腔注射给药方式,连续给药12天。实验结果发现:在给药期间,各实验组动物均未出现死亡,体重变化曲线和模型组相比较没有出现显著性差异,各实验组动物脏器系数除莪术烯中低剂量的肝组织以及阳性组的肾组织与模型组相比有些差异外,其余组别脏器与模型组相比没有出现明显的差异。以瘤重为指标计算肿瘤抑制率,结果显示莪术烯高、中、低三个剂量组的肿瘤抑制率分别为66.03%、28.34%、3.49%,阳性对照组β-榄香烯组的抑瘤率为49.57%。结果表明,莪术烯抑瘤效果与莪术烯的剂量呈剂量依赖性,显示出一定的抑瘤效果。第二章本章以肿瘤细胞特异性吸收的精氨酸为靶向载体,通过与草酰氯单乙酯耦联合成获得内源性物质草酰乙酸的类似物zt-21,并对其成药性以及机制进行研究,本章分为四节。第一节zt-21化合物的合成。利用液相合成的方法将精氨酸与草酰氯单乙酯耦联,利用hplc、ms、1h-nmr、13c-nmr等检测手段对zt-21的结构进行表征,表征结果显示所得化合物的m/z为246,与zt-21的相对分子量相符;利用萃取的方法对zt-21进行纯化,最终得到纯度为96.56%的白色或类白色蓬松状固体zt-21。第二节zt-21化合物的初步稳定性研究。主要是对zt-21化合物稳定性的影响因素试验、加速试验、长期试验进行研究。影响因素试验:zt-21在高温度(60℃)、高湿度(90%±5%rh,25℃)、强光照射(4500lx±500lx,25℃)环境下放置10天,分别于第0、5、10天取出,观察药品性状,并按照含量测定标准方法进行测定。结果表明,zt-21在高湿环境下出现吸潮凝结现象,但含量测定结果显示含量稳定,而高温和强光环境下吸潮现象不明显,且含量测定结果显示含量稳定。加速试验:zt-21在加速环境(40℃±2℃,75%±5%rh)放置6个月,在试验期内分别于第0、1、2、3、6个月末各取样一次,按照含量测定标准方法进行测定。结果表明,zt-21在加速环境下放置了6个月后含量稳定。长期试验:zt-21在常温环境(25℃±2℃,60%±10%rh)下放置12个月,在试验期内分别于第0、1、3、6、12个月末各取样一次,按照含量测定标准方法进行测定。结果表明,zt-21在常温下放置了12个月后含量稳定。第三节zt-21化合物的体内外药效学研究。体外采用mtt法研究了莪术烯对mrc-5细胞及spc-a1细胞增殖的影响。实验结果显示:不同浓度的zt-21(6.25,12.5,25,50,100μm·l-1)处理spc-a1、mrc-5细胞后,细胞的生长均未受到明显抑制。体内建立裸鼠皮下移植瘤模型,以肿瘤的质量抑制率为药效学指标,给14天药,检测ZT-21化合物对肿瘤生长的影响。实验结果显示:ZT-21高剂量(口服)、高剂量(注射)、中剂量(口服)、中剂量(注射)剂量组的抑瘤率分别为60.38%**、52.85%**、39.30%*、29.22%,阳性对照药顺铂组肿瘤抑制率为66.95%**,表明ZT-21高剂量(口服)组具有与阳性对照药顺铂组接近的抗肿瘤作用。给药期间裸鼠的体重变化结果提示,与模型组相比,从第9天开始,顺铂组动物表现出显著性差异的体重减轻情况,提示顺铂的严重毒副作用,而ZT-21各给药组与模型组相比均无显著性差异,提示ZT-21的安全性良好。第四节ZT-21化合物的抗肺癌作用机制研究。采用Real-time PCR检测ZT-21化合物对荷瘤裸鼠肿瘤组织氨基酸转运体LAT1 mRNA表达的影响。采用Western blot检测ZT-21化合物对荷瘤裸鼠肿瘤组织氨基酸转运体LAT1蛋白质表达的影响。实验结果显示:LAT1氨基酸转运体在ZT-21不同给药组对荷SPC-A1细胞瘤裸鼠肿瘤组织中LAT1表达水平与对照组相比均有一定差异性,通过与药效学结果比较发现给药后肿瘤组织中LAT1转运体的表达量与给药剂量成正相关,即给药剂量越大LAT1转运体mRN表达量A和蛋白表达量越高,肿瘤抑制率越高。综上所述,莪术烯能抑制非小细胞肺癌细胞SPC-A1的生长,并具有一定的时间依赖性和浓度依赖性,但莪术烯对人胚胎肺成纤维细胞MRC-5的生长不具有抑制作用,提示了莪术烯对肺癌细胞抑制作用具有一定的选择性。体外试验推测莪术烯主要通过将SPC-A1阻滞在G2/M期抑制肿瘤细胞有丝分裂,并下调GSTA1的表达,从而抑制SPC-A1细胞增殖。体内研究发现莪术烯对荷瘤裸鼠皮下移植瘤具有一定的抑制效果,抑瘤率与药物浓度成正相关。另外本研究自主合成的新化合物ZT-21具有一定的抗肺癌活性,而且毒副作用大大低于阳性对照药顺铂,其抗肿瘤机制可能与上调氨基酸转运体LAT1的表达有关。本论文对莪术烯与肿瘤靶向性化合物ZT-21的抗肺癌作用与机制研究,为开发高效低毒、靶点明确及作用机制明确的抗肺癌药物提供了一定的参考依据。