食管癌在全球范围内是一种高发的消化道恶性肿瘤,位居全球恶性肿瘤发病率的第8位,死亡率的第6位。食管癌发病高风险区发病率可达低风险区的500倍,表现出明显的地区差异性,其中我国为食管癌高发国家,发病率和死亡均列世界第一,严重危害我国人民健康。因此,寻找新的食管癌防治手段是我国食管癌研究领域的重要课题。近年来免疫检查点治疗(Checkpoint therapy)在多种恶性肿瘤取得了令人鼓舞的进展,已成为继手术、化疗、放疗之后人恶性肿瘤治疗领域里程碑式的进展。最新的Ⅱ期多中心临床试验显示,免疫检查点抑制剂能够有效提高晚期食管癌患者的生存率。新近有研究表明,肿瘤组织浸润淋巴细胞(Tumor-infiltrating lymphocytes,TILs)组成及相互作用、免疫细胞检查点分子表达等均与免疫治疗效果密切相关。提示,阐明肿瘤浸润关键免疫细胞亚群及其与肿瘤微环境的交互作用机制是进行有效免疫治疗干预的关键。TRM(Tissue resident memory T cells,TRM cells)细胞是新近发现的一群以高表达CD103及CD69分子为特征并特异性定植于非淋巴外周组织的记忆T细胞。TRM细胞被认为是外周组织如粘膜、皮肤、消化道及呼吸道免疫应答的第一道防线。现有的研究显示TRM细胞在病毒感染、过敏性皮炎、及多种炎症疾病中具有重要作用。小鼠感染模型研究显示TRM细胞对组织局部病原的清除能力显著强于外周血循环T细胞。提示TRM细胞在组织局部免疫稳态的维持中具有非常重要的作用。然而,TRM细胞在人类肿瘤微环境中的作用研究才刚刚开始。新近,仅有少量基于免疫组化或基因表达与预后相关性分析的研究显示肿瘤浸润TRM细胞数量与肺癌及黑色素瘤患者预后相关。因此,本研究拟依托临床生物样本资源优势,以人食管癌组织特异性记忆T细胞为切入点,试图探明食管癌浸润TRM细胞生物学特征,从而为寻找新的食管癌防治方法提供新的思路。第一部分食管癌TILs细胞亚群构成研究研究背景食管癌在全球范围内是一种高发的消化道恶性肿瘤。我国为食管癌高发国家,发病率和死亡均列世界第一,严重危害我国人民健康。近年来免疫检查点治疗(Checkpoint therapy)在多种恶性肿瘤取得了令人鼓舞的进展,已成为继手术、化疗、放疗之后人恶性肿瘤治疗领域里程碑式的进展。最新的Ⅱ期多中心临床试验显示,免疫检查点抑制剂能够有效提高晚期食管癌患者的生存率。新近有研究表明,肿瘤组织浸润淋巴细胞(Tumor-infiltrating lymphocytes,TILs)组成及相互作用、免疫细胞检查点分子表达等均与免疫治疗效果密切相关。TRM(Tissue resident memory T cells,TRM cells)细胞是新近发现的一群以高表达CD103及CD69分子为特征并特异性定植于非淋巴外周组织的记忆T细胞。TRM细胞被认为是外周组织如粘膜、皮肤、消化道及呼吸道免疫应答的第一道防线。现有的研究显示TRM细胞在病毒感染、过敏性皮炎、及多种炎症疾病中具有重要作用。小鼠感染模型研究显示TRM细胞对组织局部病原的清除能力显著强于外周血循环T细胞。提示TRM细胞在组织局部免疫稳态的维持中具有非常重要的作用。然而,TRM细胞在人类肿瘤微环境中的作用研究才刚刚开始。新近,仅有少量基于免疫组化或基因表达与预后相关性分析的研究显示肿瘤浸润TRM细胞数量与肺癌及黑色素瘤患者预后相关。我们通过单细胞分析平台Cytobank对食管癌及配对正常组织浸润 T 细胞进行 SPADE(Spanning-tree Progression Analysis of Density-normalized Events,SPADE)分析发现,人食管癌组织内CD8+TRM细胞(CD8+CD103+CD69+TRM细胞)含量较正常组织明显增高,通过传统设门分析方法我们同样确认了人CD8+TRM细胞特异性表达于食管癌组织及配对正常食管组织,且人食管癌组织CD8+TRM细胞含量较正常组织明显增高。以上初步研究结果提示:CD8+TRM细胞的异常增高是人食管癌炎性微环境内T细胞组成改变的非常重要的一个特征。因此,进一步探明CD8+TRM细胞在人食管癌免疫微环境中的作用及其参与肿瘤免疫应答及调控的潜在机制,能为寻找靶向干预食管癌免疫微环境关键细胞的免疫治疗新策略提供方向。目的探明食管癌组织内异常增高或降低的关键TILs细胞亚群。从而明确CD8+TRM细胞在食管癌组织TILs细胞中的地位。方法这部分研究工作将在医院伦理委员会批准和患者知情同意下,告知患者研究相关事项并签署知情同意书后,首先收集食管癌手术患者配对新鲜肿瘤组织和相对正常食管组织,通过原代组织浸润淋巴细胞分离方法制备单细胞悬液。然后通过多色荧光抗体标记,高通量多色流式检测食管癌及配对正常组织内TILs细胞及其亚群表达情况,探明食管癌组织内异常增高或降低的关键TILs细胞亚群。从而明确CD8+TRM细胞在食管癌组织TILs细胞中的地位。为下一步分离并鉴定食管癌CD8+TRM细胞在食管癌组织内的分布及特征奠定基础。结果(1)对人食管癌及配对正常组织CD3+T细胞SPADE分析显示人食管癌组织TRM细胞较配对正常组织在比例及数量上均显著增高。(2)流式设门分析显示人食管癌组织TRM细胞较配对正常组织在比例及数量上均显著增高。结论CD8+TRM细胞在人食管癌组织显著富集。第二部分食管癌浸润CD8+TRM细胞亚群、分布、表型及生物学特征研究研究背景目前TRM细胞被认为具有以下特征:(1)具有长时期自我更新能力;(2)大量表达于上皮粘膜等免疫屏障组织;(3)识别微生物产物、细胞因子、危险信号分子及应激相关配体;(4)快速分泌多种炎症因子。经典的感染免疫学研究显示,在初始感染后小鼠阴道粘膜CD8+TRM细胞能够快速识别病原并产生特异性免疫记忆;而再次接触同类抗原的时候通过分泌大量细胞因子促进体液免疫应答、DC细胞成熟及自然杀伤细胞活化。提示TRM细胞广泛参与机体多种免疫应答的调节。但其在肿瘤发生发展中的作用尚不清楚。我们前期的研究发现CD8+TRM细胞在人食管癌组织内显著增高,加之先前的研究显示CD8+TRM细胞在慢性炎症模型中能够启动固有免疫及获得性免疫,并能对多种免疫应答进行调控。由此我们推测CD8+TRM细胞是人食管癌炎症免疫失调及肿瘤进展的关键因素之一。目的这部分研究工作重点通过多种CD8+TRM细胞相关细胞表面标记抗体,运用多色流式检测分析技术,检测食管癌及其配对正常组织单细胞悬液内CD8+TRM细胞的亚群、组织分布及其他表型特征。阐明食管癌组织浸润CD8+TRM细胞的组织分布、分化相关表型表达特征。从而初步明确其分化表型及组织趋向性等基本生物学特征。为进一步明确其在食管癌相关炎症组织中功能重塑及进一步极化的调控机制打下基础。方法(1)食管癌浸润CD8+TRM细胞组织分布特征检测:取手术切除新鲜配对食管癌及正常组织,无菌环境制备单细胞悬液,然后通过多色流式检测(CD45、CD3、CD8、CD103、CD69),分析不同组织CD8+TRM细胞比例及数量。(2)分化相关表型鉴定:通过多色流式检测(CD45、CD3、CD8、CD103、CD69、CD45RA、CD45RO),分析肿瘤及配对正常组织浸润CD8+TRM细胞分化相关表型特征。(3)免疫检查点分子检测:通过多色流式检测(CD45、CD3、CD8、CD103、CD69、PD-1、Tim-3),分析肿瘤及配对正常组织浸润CD8+TRM细胞免疫检查点分子表达特征。结果(1)食管癌肿瘤浸润T细胞以CD4和CD8细胞为主,因此我们对人食管癌配对组织CD8+TRM细胞及CD4+TRM细胞进一步分析显示,食管癌患者配对正常食管组织及肿瘤中均表达较高比例的CD8+TRM细胞及CD4+TRM细胞。然而,统计学分析显示人食管癌组织CD8+TRM细胞比例和绝对数量均较配对正常组织均显著增高(P<0.0001)。相反,虽然CD4+TRM细胞数量在食管癌组织也呈增高趋势,但其在人食管癌组织中比例较配对正常食管组织却呈降低趋势。(2)我们对人食管癌及配对正常组织CD3+TRM细胞的研究显示,人食管癌浸润CD3+TRM细胞较正常配对组织显著增高。进一步分析显示,人食管癌及配对正常食管组织TRM细胞主要以CD8+TRM细胞和CD4+TRM细胞为主,仅有少量TRM细胞亚群为γδT细胞和iNKT细胞。更重要的是我们对肿瘤组织TRM细胞亚群的平行比较发现,人食管癌浸润CD8+TRM细胞在比例和数量上较其余TRM细胞亚群均占有绝对优势。(3)基于小鼠慢性自身免疫性疾病模型的研究显示,持续存在于病变组织的CD8+TRM细胞表现为免疫耗竭状态(Immune exhaustion),且能持续募集促炎性CD4+Th细胞及巨噬细胞。提示,在慢性炎症持续存在的情况下CD8+TRM细胞发生免疫耗竭,并进一步促进局部炎症反应。我们的研究显示,人食管癌及配对正常食管组织TRM细胞以效应记忆T细胞(Effector memory T cells,TEM)及中央型记忆T细胞(Central memory T cells,TCM)为主,进一步研究显示,人食管癌组织CD8+TRM细胞PD-1表达较配对正常食管组织显著增高。我们通过viSNE(visual stochastic network embedding,viSNE)分析也同样证实 了人食管癌组织CD8+TRM细胞PD-1表达较配对正常食管组织显著增高。提示,人食管癌炎性免疫微环境内某些因素促进CD8+TRM细胞免疫耗竭。而肿瘤微环境内慢性炎症的持续存在已被公认与肿瘤免疫调控失衡密切相关。因此,我们有理由相信人食管癌组织CD8+TRM显著增高并表现为免疫耗竭状态这一现象与肿瘤炎性微环境稳态失衡有密切关联。结论(1)CD8+TRM细胞在人食管癌组织浸润TRM细胞中占主导地位。(2)人食管癌浸润CD8+TRM细胞表现为免疫耗竭表型。第三部分 食管癌浸润TRM细胞与肿瘤临床病理特征及预后相关性研究研究背景以上研究证明CD8+TRM细胞在人食管癌组织浸润TRM细胞中占主导地位,通过分析食管癌浸润CD8+TRM细胞数量与肿瘤临床特征及预后的相关性,为靶向干预食管癌相关炎症免疫调节的关键细胞(分子)提供新的思路,也为临床运用CD8+TRM细胞作为食管癌预后预测指标及靶向干预CD8+TRM细胞介导的食管癌免疫抑制提供了潜在可能性,具有临床转化意义。目的这部分研究工作重点将应用既往患者食管癌组织芯片或石蜡切片通过免疫组织化学染色的方法,对122例食管癌患者肿瘤组织内CD8+TRM细胞数量进行检测,结合患者临床资料,分析CD8+TRM细胞数量与肿瘤TNM分期、临床病理特征的相关性。从而明确人CD8+TRM细胞与食管癌临床病理特征及预后的相关性。方法(1)应用既往患者食管癌组织芯片或石蜡切片通过免疫组织化学染色的方法,对122例食管癌患者肿瘤组织内CD8+TRM细胞数量进行检测。(2)食管癌浸润CD8+TRM细胞与患者临床病理特征的相关性分析:收集患者临床资料,分析CD8+TRM细胞数量与肿瘤TNM分期及其他临床病理特征的相关性。(3)食管癌浸润CD8+TRM细胞与患者预后相关性分析:应用既往患者食管癌组织芯片免疫组织化学染色的方法,分析CD8+TRM细胞数量与患者预后的关系。结果(1)CD8+TRM细胞数量高的食管癌患者总生存期高于CD8+TRM细胞数量低的食管癌患者,(log-rank P<0.05)(2)CD8+TRM细胞数量高的食管癌患者无病生存期高于CD8+TRM细胞数量低的食管癌患者,(log-rank P<0.05)结论(1)CD8+TRM细胞高表达的食管癌患者预后良好,CD8+TRM细胞可以作为一个判断食管癌患者预后的生物学指标。(2)CD8+TRM细胞可以作为预测指标筛选接受免疫治疗临床实验的食管癌患者。