血管新生参与乳腺癌发生发展、浸润、转移和复发。肿瘤血管新生的关键步骤包括血管内皮激活、增殖、迁移与成管。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)主导肿瘤血管新生。肿瘤缺氧、炎症与凝血参与调节VEGF分泌,通过VEGF受体2(VEGFR2)信号通路诱导血管新生。其中,VEGFR2介导的钙调神经磷酸酶(calcineurin, CaN)/活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells, NFAT)信号通路在乳腺癌血管新生中起主导作用。清毒颗粒由柴胡、郁金、陈皮、牡丹皮、黄芪、甘草、槐花、紫草、莪术、丹参十味中药组成,有疏肝解郁、滋阴凉血、活血散结的功效,中医临床用于治疗乳腺癌。本研究在前期工作的基础上,采用动物、细胞及分子实验,从VEGFR2及肿瘤相关炎症两条途径,探讨清毒颗粒抗乳腺癌血管新生的药效及药理。第一部分清毒颗粒抗裸鼠荷人乳腺癌血管新生的药效1.裸鼠荷人乳腺癌模型的复制目的：复制裸鼠荷人乳腺癌模型。方法：将浓度为1×106～8×106个/200μL(k=0.5)的MCF-7单细胞悬液接种于裸鼠乳房脂肪垫,测量肿瘤体积,回归MCF-7接种的半数有效浓度(EC50)。结果：MCF-7的EC50及95%置信区间分别为4.75×106个/200μL和3.50x106-6.30×106个/200μL,相关方程为Y=2.93+0.41/(1+10(26.41-3.96x)),R=0.99。结论：成功复制了裸鼠荷人乳腺癌模型。2.槲皮素抑制裸鼠荷人乳腺癌的量效目的：槲皮素抑制裸鼠荷人乳腺癌肿瘤生长的量效关系。方法：荷人乳腺癌裸鼠随机分为8组。槲皮素组以剂量3162.28～3162277.66nmol/kg/d (k=0316)连续灌胃21d。每周2次测量体重与肿瘤体积,回归槲皮素抑制肿瘤生长的量效关系。结果：槲皮素抑制肿瘤生长的ED50为45380.0Onmol/kg/d,其95%置信区间为34316.00-60011.00nmol/kg/d,量效方程为Y=9.27+64.41/(1+10(8.88-1.91x)),R=0.99。结论：槲皮素抑制乳腺癌生长具有剂量依赖性。3.清毒颗粒抑制裸鼠荷人乳腺癌的量效目的：清毒颗粒抑制裸鼠荷人乳腺癌肿瘤生长的量效关系。方法：荷人乳腺癌裸鼠随机分为8组。槲皮素界定剂量(31.62～31622.78nmol/kg/d,k=0.316)的清毒颗粒连续灌胃21d。每周2次测量体重与肿瘤体积,回归清毒颗粒抑制肿瘤生长的量效关系。结果：清毒颗粒抑制肿瘤生长的ED50为1403nmol/kg/d,其95%置信区间为435.90～4518.00nmol/kg/d,量效方程为Y=72.57+70.41/(1+10(0.94x-2.95)),R=0.99。结论：清毒颗粒抑制乳腺癌生长具有剂量依赖性,ED50为槲皮素单独给药的约1/40。4.清毒颗粒抑制裸鼠荷人乳腺癌血管新生的药效机制目的：采用荷人乳腺癌裸鼠,分析清毒颗粒抑制CaN活性抗乳腺癌血管新生的作用。方法：荷人乳腺癌裸鼠随机分为7组,模型组、阳性药三苯氧胺(TAM)组和他克莫司(FK506)组、槲皮素(Qu)组、清毒颗粒低(QDL)、中(QDL)、高(QDL)剂量组,给药21d。检测肿瘤体积、肿瘤坏死体积比、癌细胞增殖、血清VEGF含量、肿瘤血管密度和CaN活性,采用免疫组化、实时定量RT-PCR和Western blot法检测肿瘤组织内VEGF、VEGFR2和NFATc3的表达水平。结果：清毒颗粒抑制肿瘤生长,抑瘤率分别为20.70%、22.43%、22.27%,促进肿瘤坏死、抑制癌细胞增殖、减少血清VEGF含量、降低血管密度、下调CaN活性。清毒颗粒不同程度地降低VEGF、VEGFR2和NFATc3的原位蛋白表达、基因水平和蛋白含量。结论：清毒颗粒下调CaN活性,抑制裸鼠荷人乳腺癌血管新生。第二部分清毒颗粒抑制促癌炎症抗乳腺癌血管新生的药理1.大鼠眼前房荷人乳腺癌模型的建立目的：建立大鼠眼前房荷人乳腺癌模型。方法：将梯度密度MCF-7单细胞悬液(2.5×104～8×105个/mL,k=0.5)减压接种于大鼠眼前房,每日观察记录眼球红色强度,d28处死动物。HE染色观察眼前房肿瘤病理特征、形态计量肿瘤体积比,回归细胞接种密度与肿瘤体积比的量效关系；免疫组化染色检测肿瘤组织内vWF与CD4原位表达。结果：do-d1o眼球逐渐变红,伴有云雾状血管形成；d1o以后红色逐渐消退。病理观察显示随着细胞接种密度升高,肿瘤体积增加；癌细胞起始生长在睫状体,逐渐占据眼前房,随后破坏玻璃体和晶状体,肿瘤组织内有大量含铁血黄素沉积。MCF-7接种的EC50及95%置信区间分别为5×105个/mL和2.31×105-1.05×106个/mL。随着细胞接种密度升高,内皮vWF阳性表达增加,T淋巴细胞CD4阳性颗粒增多。结论：前房红色强度半定量时效与肿瘤体积比定量量效,可建立大鼠眼前房乳腺癌血管新生模型,该模型可用于分析血管新生与肿瘤免疫。2.清毒颗粒抑制乳腺癌炎性血管新生的药理机制目的：采用眼前房荷人乳腺癌大鼠,探索清毒颗粒抑制炎性血管新生的药理机制。方法：眼前房荷人乳腺癌模型大鼠随机分为8组,对照组(接种PBS)、模型组、阳性药三苯氧胺组和FK506组、槲皮素组、清毒颗粒低、中、高剂量组,给药28d。HE染色观察眼前房肿瘤组织,形态计量肿瘤体积比；免疫组化染色显示前房肿瘤组织中vWF,浸润炎性细胞中COX-2、IL-1β、IL-6、STAT3、STAT1、IRF1的细胞定位,形态计量原位阳性表达水平。结果：清毒颗粒不同程度抑制眼前房肿瘤生长、降低血管密度、抑制COX-2、IL-1p、IL-6和STAT3表达,上调STAT1和IRF1表达。结论：清毒颗粒通过下调促癌炎症信号抗乳腺癌血管新生。第三部分清毒颗粒抑制乳腺癌血管新生的药理机制1.清毒颗粒抑制乳腺癌诱导血管新生目的：分析清毒颗粒对人乳腺癌分泌VEGF的影响。方法：以正常、TAM、FK506、Qu、QDL、QDM、QDH含药血清作用于MCF-7细胞,MTT法检测增殖,Elisa法检测培养基上清中VEGF含量,实时定量RT-PCR和Western blot法检测VEGF表达。结果：清毒颗粒抑制MCF-7细胞增殖、减少VEGF分泌、降低VEGF基因与蛋白表达。结论：清毒颗粒阻抑MCF-7细胞VEGF的恶性循环。2.清毒颗粒抑制癌源性内皮血管形成的机制目的：探讨清毒颗粒影响癌源性内皮血管新生的药理机制。方法：(1)分离培养人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)；(2)回归VEGF刺激内皮增殖的量效关系；(3)以培养细胞接触性抑制的时效与量效,建立癌细胞-内皮共培养肿瘤血管新生离体模型。MCF-7以102.5～104.5个/mL(k=0.316)5个浓度接种,培养6h、12h、24h、36h、48h、72h、96h、120h、144h、168h、192h、240h、288h、336h后终止；HUVEC以103-105个/mL(k=0.316)5个浓度接种,培养12h、24h、36h、48h、72h、96h、120h、144h、168h后终止；HE染色后对不同浓度各时间点的细胞数目进行计数,回归细胞发生接触性抑制的浓度(y)与时间(x)的关系；(4)以正常、TAM、FK506、Qu、QDL、QDM、QDH含药血清作用于VEGF诱导或MCF-7共培养的内皮,MTT法检测增殖,transwell法分析迁移,Magial基质胶观察成管,检测CaN活性,免疫组化染色检测NFATc3入核,实时定量RT-PCR和Western blot检测NFATc3表达。结果：(1)HUVEC检出率>90%；(2)VEGF刺激HUVEC增殖的EC50为15.58ng/mL；(3)终点时程决定MCF-7细胞接种密度的回归方程为y=5.07x2-1949x+185642(R=0.99)；终点时程决定HUVEC细胞接种密度的回归方程为y=0.50x2-722.30x+249774(R=0.87)；(4)清毒颗粒抑制VEGF诱导或MCF-7共培养的内皮迁移、成管,下调CaN活性,减少NFATc3入核,降低NFATc3的基因与蛋白表达。结论：清毒颗粒通过抑制内皮NFAT通路抗乳腺癌血管新生。