目的:胰腺癌（Pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC）是指发生于胰腺外分泌腺的恶性肿瘤,由于患者患病预后较差,五年生存率不足6%,因此具有“癌中之王”的称号^[1]。PDAC起病隐匿,在患者患病早期即发生局部浸润和癌细胞转移,目前临床上主要通过检测患者血液中糖链抗原19-9（Carbohydrate antigen19-9,CA19-9）的含量进行筛查^[2],但由于CA19-9的敏感性相对较低,导致早期诊断困难,另外在胰腺癌的治疗过程中表现出对放疗不敏感,容易对现有化疗药物产生耐药等原因导致胰腺癌死亡率居高不下。在美国,PDAC已成为当前癌症致死率排行榜的第3名,并有可能在2030年超越乳腺癌成为第二大致死性肿瘤^[3,4]。近20年的统计数据表明,我国胰腺癌发病率约增加6倍,在所有致死癌症中排名第6^[5]。以往认为,胰腺癌的发生发展受到环境因素、个人生活习惯及其他健康疾病的影响,但对于胰腺癌的发病机制了解有限,因此深入了解胰腺癌早期发病机制,找到胰腺癌发病的相关分子标记,对胰腺癌及时诊断、控制及治疗具有重要意义。近年来,越来越多的研究指出长链非编码RNA（Long non-coding RNA,lncRNA）在胰腺癌的病情进展过程中发挥重要作用。lncRNA是一类长度大于200个核苷酸的非编码RNA^[6],是生物体内重要的调控因子,广泛参与生物体内的多种生命活动过程,在表观遗传调控、细胞周期调控及细胞分化调控等多种生命活动中发挥重要作用^[7-11]。Karreth FA等^[12]提出的竞争性内源RNA（competitive endogenous RNA,ceRNA）假说,即lncRNA可作为ceRNA与miRNA竞争性结合,干扰miRNA与下游靶基因的结合,调控基因表达,进而参与细胞的增殖、分化、凋亡及血管生成等各个生物学过程^[13,14],同时多项研究表明lncRNA与胰腺癌的发生存在关联,如Sun等^[15]在研究中发现lncRNA H19、PTK1在胰腺癌组织中表达量升高,进一步研究后发现lncRNA H19与miR-194竞争性结合,可上调PTK1的表达水平,从而促进胰腺癌细胞的增殖、迁移过程;Gao等^[16]指出lncRNA DLEU1可通过与miR-381结合,调控CXCR4的表达水平,促进胰腺癌恶化;在Wang等^[17]的研究中发现,美瑞汀诱导可提高胰腺癌细胞中lncRNA NONHSAT105177的表达量,并可抑制胰腺癌细胞的增殖。可见,lncRNA在PDAC中的作用不可忽略。OIP5基因（Opa Interacting Protein 5,OIP5）于1988年被首次发现^[18],其编码产生的蛋白是着丝粒结构和功能形成所必须的成分,已有多项研究表明OIP5基因参与人胃癌、结肠癌及女性急性髓系白血病的发生发展过程^[19-21]。lncRNA OIP5-AS1是编码OIP5基因的反义转录产物,已被证明在多项疾病中发挥促肿瘤作用,如Liu等^[22]在研究胶质瘤的发病机制过程中发现lncRNA OIP5-AS1的高表达可增强胶质瘤细胞增殖、扩散能力,其主要机制是通过与miR-367-3p竞争性结合,促进CEBPA的表达,进而在癌症的发生发展过程中发挥正调节作用;Zhang等^[23]在研究中发现lncRNA OIP5-AS1通过与miR-186a-5p结合,抑制miR-186a-5p对ZEB1的干扰作用,上调ZEB1基因表达水平,从而促进肝母瘤细胞的增殖、分化过程;在宫颈癌组织及细胞中lncRNA OIP5-AS1的表达水平较高,并可与miR-143-3p竞争性结合,上调ITGA6及SMAD3的表达,从而增强宫颈癌细胞的增殖、迁移能力,发挥促癌作用^[24,25],然而关于其在胰腺癌中的研究未见报道。我们前期利用生物信息学在线软件分析发现lncRNA OIP5-AS1与miR-342-3p之间存在结合位点。同时研究发现,排列于特定基因簇区域的miRNA在恶性肿瘤发展过程中往往有相似的表达模式^[26],并有多项研究证实miRNA参与肿瘤的发展过程。有报道指出miR-342-3p在结直肠癌^[27]、胆囊癌^[28]及前列腺癌^[29]的病情进展中发挥重要的调控作用,且Permuth-Wey J等^[30]的研究中发现miR-342-3p在乳头状粘液瘤组织中的表达水平降低,乳头状粘液瘤是PDAC的前身。于是我们推测lncRNA OIP5-AS1可能通过吸附miR-342-3p发挥促进胰腺癌发展的作用。但是,miR-342-3p在PDAC中的作用机制仍需进一步探讨。研究表明,细胞内磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B（Phosphoinositide3-kinase/Protein kinase B,PI3K/AKT）信号通路的活性及其上、下游分子表达模式的突然改变与肿瘤的发生过程密切相关^[31],PI3K/AKT通路活化,可激活原癌/抑癌基因的表达,从而参与肿瘤的发生过程,如Zhao等^[32]研究发现mi R-21的表达水平与MAPK/ERK、PI3K/AKT信号通的活化状态存在正相关关系,miR-21表达水平升高可使PI3K/AKT通路活化,进而增强PDAC细胞的扩增能力;Xiong等^[33]指出mi R-107的表达水平下调可抑制PI3K/AKT通路的活性及caveolin-1、PTEN蛋白的表达水平,抑制PDAC细胞的增殖、侵袭能力;提示,miRNA与PI3K/AKT通路密切相关。值得注意的是Liu等^[34]在肝癌的研究过程中发现miR-342-3p可调控PI3K/AKT/GLUT1信号通路的活化状态,活化后的PI3K/AKT/GLUT1信号通路可激活下游靶基因,减少肝癌细胞的糖摄取量,进而降低糖酵解水平及ATP产量、细胞外酸化率,增加肝癌细胞中的耗氧率,抑制肝癌细胞增殖。于是我们推测在胰腺癌的发病过程中miR-342-3p与PI3K/AKT通路之间同样存在调控关系。综上所述,我们提出合理的科学假说:在胰腺癌的发生发展过程中lncRNA OIP5-AS1可能发挥ceRNA的作用,调控miR-342-3p的表达水平,从而发挥促癌功能。本研究将对lncRNA OIP5-AS1与miR-342-3p之间的调控关系及lncRNA OIP5-AS1是否可以通过调控miR-342-3p及其下游信号通路来影响胰腺癌细胞的增殖进行研究,并初步阐述相关机制。研究方法:从2015年9月至2018年5月,收集中国医科大学附属盛京医院行胰腺癌手术病人的癌和癌旁标本28对,这些病人术前未经过放化疗。所有收集的标本立刻放入液氮中并在提取RNA前保存在-80度冰箱中。这项研究得到了伦理委员会的批准。采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR,quantitative real-time polymerase chain reaction）检测了lncRNA OIP5-AS1和mi R-342-3p在胰腺癌和癌旁中的表达,分析OIP5-AS1和miR-342-3p在胰腺癌和癌旁中表达的相关性,并通过GEPIA数据库对胰腺癌中高表达OIP5-AS1和低表达OIP5-AS1进行生存分析。体外实验,分别选取高表达OIP5-AS1的胰腺癌细胞系ASPC-1、PANC-1和低表达miR-342-3p的胰腺癌细胞系ASPC-1、BXPC-3进行抑制和过表达实验,利用CCK-8检测胰腺癌细胞增殖的变化,免疫荧光检测Ki67的表达,流式细胞技术检测胰腺癌细胞周期的变化和Western blot检测细胞周期蛋白cyclinD1、CDK4、CDK6,明确lncRNA OIP5-AS1和miR-342-3p对胰腺癌细胞增殖的影响。构建含有miR-342-3p结合位点的野生型lncRNA OIP5-AS1、AGR2种子序列载体（wt-OIP5-AS1、wt-AGR2）、突变型OIP5-AS1、AGR2种子序列载体（mut-OIP5-AS1、mut-AGR2）分别与miR-342-3p mimic或者NC mimic共转染一株工具细胞,双荧光素酶实验检测miR-342-3p与OIP5-AS1和AGR2的结合。采用lncRNA OIP5-AS1 siRNA或者NC siRNA分别与miR-342-3p inhibitor或者NC inhibitor共转染细胞,CCK-8检测转染后细胞的活性,免疫荧光检测转染各组细胞Ki67的表达情况,Western blot检测转染后cyclinD1、CDK4、CDK6、AGR2、AKT、p-AKT（Ser473）、ERK1/2、p-ERK1/2（Thr202/Tyr204）的表达,明确lncRNA OIP5-AS1是否通过miR-342-3p及其下游信号通路影响胰腺癌细胞的增殖。体外裸鼠成瘤实验,分为对照组、NC shRNA组、OIP5-AS1 shRNA组,实验结束取瘤体称重,荧光定量PCR检测瘤组织中lncRNA OIP5-AS1和miR-342-3p的表达,免疫组化检测瘤组织中Ki67的表达,Western blot检测瘤组织中cyclinD1、CDK4、CDK6、AGR2、AKT、p-AKT（Ser473）、ERK1/2、p-ERK1/2（Thr202/Tyr204）的表达,明确lncRNA OIP5-AS1对胰腺癌体内生长的影响。结果:临床水平采用qRT-PCR检测结果显示,与癌旁组织相比,lncRNA OIP5-AS1在胰腺癌组织中的表达水平显著上调,而miR-342-3p在胰腺癌组织中的表达水平显著下调。体外选取适宜细胞系,采用siRNA干扰lncRNA OIP5-AS1或采用mimic过表达miR-342-3p后,采用CCK-8检测细胞增殖、免疫荧光检测Ki67的表达、流式细胞术检测细胞周期及Western blot检测细胞周期相关指标的表达,结果显示干扰lncRNA OIP5-AS1或过表达miR-342-3p均可抑制细胞增殖、降低Ki67表达水平、诱发细胞周期阻滞、下调cyclinD1、CDK4及CDK6的表达。同时采用双荧光素酶实验证实lncRNA OIP5-AS1和AGR2与miR-342-3p可直接结合,且干扰lncRNA OIP5-AS1可抑制AGR2与AKT-ERK信号通路的活化,另外发现lncRNA OIP5-AS1可充当miR-342-3p的吸附海绵抑制其表达和功能,检测结果显示mi R-342-3p inhibitor可有效逆转干扰lncRNA OIP5-AS1对胰腺癌发生与发展的影响。此外,我们还在建立裸鼠成瘤动物模型,发现采用shRNA沉默肿瘤中lncRNA OIP5-AS1可显著抑制肿瘤的体积,且肿瘤组织中lncRNA OIP5-AS1的表达水平下调,而miR-342-3p的表达上调。随后采用免疫组化检测肿瘤组织中Ki67的表达水平、Western blot检测细胞周期与AKT/ERK信号通路相关分子的表达水平,结果显示沉默lncRNA OIP5-AS1可显著抑制肿瘤组织中cyclinD1、CDK4、CDK6、AGR2、p-AKT及p-ERK的表达水平。结论:证实了lncRNA OIP5-AS1在胰腺癌中发挥促癌作用,且干扰lncRNA OIP5-AS1可经海绵吸附miR-342-3p抑制AGR2的表达,进而抑制AKT/ERK信号通路的活化,从而发挥抑制胰腺癌发生与发展的功能。