论文部分内容阅读
研究内容一 18F-DPA-714 对外周性炎症PET 显像的价值及外周炎症对18F-DPA-714 摄取的规律
目的：通过建立小鼠外周性肌肉炎症模型，本部分内容主要研究18p-DPA-714，一种新型巨噬细胞转动蛋白(translocator protein,TSPO) 靶向示踪剂，在体外及体内对巨噬细胞的示踪能力，及其对外周性肌肉炎症PET 显像的价值及摄取规律，从而为炎症特异性PET 显像提供一种新方法。
方法：体外细胞实验包括利用小鼠巨噬细胞系RAW 264.7，分析其对18p-DPA-714 的细胞摄取(cell uptake) 与细胞释放(cell efflux) 特点，其中部分细胞同时使用TSPO 阻断剂PK11195 ，来验证细胞摄取的特异性。体内显像实验使用PVB 小鼠，通过肌肉注射20μl松节油的方法建立小鼠下肢肌肉炎症模型，并在炎症建模后的不同时间点(1，3，6，10,14,19 及26 天)行小鼠18p-DPA-714microPET 显像，用感兴趣区(ROI)法勾画并测定不同时间点小鼠炎症肌肉对18p-DPA-714 的摄取值，绘制时间-摄取曲线，纵向研究炎症对示踪剂摄取的规律。同时，在炎症建模后的第3天，选取若干模型小鼠行TSPO 阻断剂PK11195 取代(displacement) 实验，并通过1 小时动态PET 显像绘制炎症肌肉处对示踪剂摄取的动态曲线(dynamic curve) ，来验证其对18p-DPA-714 摄取的阻断效果。取建模后第1 天及第6 天的小鼠炎症肌肉组织做冰冻切片，对其行CD 68 巨噬细胞免疫荧光染色，研究其与PET 显像的相关性。取建模后第1、6、22 天的小鼠炎症肌肉做冰冻切片，行18p-DPA-714 放射性自显影分析，研究其与PET 显像的相关性。
结果：巨噬细胞对18p-DPA-714 的摄取在共孵育开始到1小时内呈逐渐升高趋势，1 小时巨噬细胞对示踪剂的摄取可达45.55±1.73%AD。该摄取可被阻断剂PK11195 选择性地阻断。细胞释放实验，在更换培养基1 小时后仍有21.55±2.05%AD 的放射性保留在巨噬细胞内，2 小时后该值为9.04±1.12%AD。小鼠microPET 显像实验中，炎症处肌肉在建模后第6天摄取达到最高峰(4.02±0.64 %ID/g），之后开始缓慢摄取下降，建模后第26天炎症处摄取为2.77±0.64 %ID/g。建模后3天的1小时动态阻断剂取代显像中，炎症处18F-DPA-714摄取可被PK11195特异性地取代。放射自显影结果显示炎症建模后第6天切片对18F-DPA-714的结合明显高于第1天及第22天。CD 68巨噬免疫荧光染色发现，炎症建模后第6天炎症肌肉切片较炎症后第1天肌肉切片有更多的荧光信号。
结论：18F-DPA-714是一种巨噬细胞TSPO特异性PET示踪剂，可以用来动态监测炎症部位巨噬细胞的浸润。慢性炎症对18F-DPA-714的摄取要高于急慢性期炎症，表明慢性炎症阶段有更多的巨噬细胞浸润。
研究内容二 小鼠外周炎症模型炎性新生血管18F-AlfatideⅡ显像
目的：18F-Alfatide Ⅱ(18F-AF-NOTA-E[PEG4-C(RGDfk)]2）为新生血管靶向性示踪剂。本研究旨在探索18F-AlfatideⅡmicroPET显像在炎症性新生血管成像中的价值及可行性，并分析急性与慢性炎症对18F-AlfatideⅡ摄取的变化规律。
方法：细胞实验使用小鼠来源巨噬细胞系RAW246.7，研究其在正常件下对18F-AlfatideⅡ的细胞摄取水平（cell uptake）。动物实验使用FVB小鼠，通过肌注20μl松节油建立后肢肌肉炎症模型。并在炎症建模后的不同时间点（第1，2，4，8，12，16及26天）行小鼠18F-AlfatideⅡmicroPET显像，用感兴趣区(ROI)法勾画并测定不同时间点小鼠炎症肌肉对18F-Alfatide Ⅱ的摄取值，绘制时间-摄取曲线，纵向研究炎症对示踪剂摄取的规律。同时，在炎症建模后的第9天，选取若干模型小鼠，在PET显像前注射没有放射性标记的RGD多肽(10 mg/kg)，再行18F-AlfatideⅡPET显像，来验证炎症肌肉处对18F-Alfatide Ⅱ摄取的特异性。取建模后第1天及第12天的小鼠炎症肌肉组织做冰冻切片，对其行CD 31血管内皮细胞免疫荧光染色，研究其与PET显像的相关性。
结果：巨噬细胞对18F-AlfatideⅡ的摄取呈现明显的低水平，在摄取实验2小时点，巨噬细胞对示踪剂的摄取仅有0.18±0.03%AD。MicroPET显像中，炎症肌肉处的18F-Alfatide Ⅱ在第2～12天内的摄取逐渐升高趋势，在炎症慢性期（建模后第12天）18F-Alfatide Ⅱ摄取出现最大值(1.87±0.35 %ID/g)。注射了未标记的RGD阻断剂的模型小鼠的炎症处18F-AlfatideⅡ摄取明显低于未注射该阻断剂组（1.66±0.04 vs. 0.77±0.16 %ID/g,P=7.33×10-4）。CD 31荧光染色可见小鼠炎症建模后第12天炎症肌肉切片CD 31荧光强度信号明显高于第1天，与PET显像结果相一致。
结论：巨噬细胞表面较少表达整合素αvβ3，炎症处对18F-AlfatideⅡ的摄取来自炎性新生血管。18F-AlfatideⅡPET显像能动态而准确地监测炎性新生血管在炎症进展中的动态变化情况。慢性炎症阶段18F-AlfatideⅡ摄取显著高于急性期炎症摄取，表明慢性期新生血管程度要明显高于急性炎症期。
研究内容三 巨噬细胞清除后炎症模型18F-DPA-714及18F-Alfatide ⅡPET显像及清除巨噬细胞对炎性新生血管的影响
目的：本研究旨在利用18F-Alfatide Ⅱ(18F-AIF-NOTA-E[PEG4-C(RGDfk)]2）microPET新生血管显像及18F-DPA-714巨噬细胞TSPO显像，探索巨噬细胞清除后小鼠肌肉炎症模型的炎症部位对两种示踪剂摄取的变化，并分析两者的联系，研究巨噬细胞清除对炎性新生血管的作用。
方法：动物实验使用FVB小鼠，通过肌注20μl松节油建立后肢肌肉炎症模型。将炎症模型小鼠随机分成3组，每组4只，其中组1及组2小鼠在第3天接受尾静脉注射1.4 mg (200 μl)氯膦酸二钠脂质体(Clodronate Liposomes，Clophosome)，之后每2-3天接受尾静脉注射0.7 mg(100μl)氯膦酸二钠脂质体（方案1）。组3小鼠在炎症模型建模开始前2天接受尾静脉注射1.4 mg(200 μl)氯膦酸二钠脂质，之后每2-3天接受尾静脉注射0.7 mg(100μ)氯膦酸二钠脂质体（方案2）。组1的小鼠在炎症建模后的第6，10及14天行18F-DPA-714 PET显像，观察巨噬细胞清除过程中炎症部位对示踪剂摄取的动态变化情况。组2及组3的小鼠在炎症建模后的第12天进行了18F-AlfatideⅡPET显像，比较不同巨噬细胞清除方案下对炎性新生血管程度的影响。取炎症建模后第6天及第12天接受了巨噬细胞清除剂干预的小鼠炎症肌肉行冰冻切片，并对其进行CD 68巨噬细胞免疫荧光染色及CD 31血管内皮细胞染色。染色结果与PET显像进行比较。
结果：相对于同时期未接受巨噬细胞清除小鼠，接受了巨噬细胞清除(方案1)的小鼠炎症对18F-DPA-714摄取在建模后第6天及第10天明显降低（第6天：3.30±0.18 v.s. 4.02±0.64 %ID/g，P=0.02; 第10天：3.16±0.32 v.s. 3.70±0.43 %ID/g,P=0.03）。炎症后第14天，除去巨噬细胞组与未除去巨噬细胞组的18F-DPA-714摄取未显现出明显的差异(3.03±0.69 vs. 3.50±0.43 %ID/g，P=0.19)。接受除巨噬细胞方案2的小鼠，其建模后第12天的炎症处18F-AlfatideⅡ摄取较接受除巨噬细胞方案1组小鼠炎症对示踪剂摄取减低（0.98±0.19 v.s. 1.49±0.13 %ID/g，P=2.97×10-4）。接受了巨噬细胞清除的炎症肌肉CD 68、CD 31荧光信号明显小于同期未接受巨噬细胞清除的炎症肌肉，与PET显像结果相一致。
结论：巨噬细胞清除后，炎症部位18F-DPA-714摄取降低，表明18F-DPA-714PET显像可以观察到巨噬细胞的数目变化情况。巨噬细胞清除后炎症处18F-AlfatideⅡ摄取下降，表明巨噬细胞清除可减少炎症部位炎性新生血管的生成，并可通过18F-AlfatideⅡPET显像进行监测。
研究内容四 18F-DPA-714 PET 显像在鉴别肿瘤与炎症中的价值
目的：通过建立肿瘤小鼠模型与炎症小鼠模型，本研究旨在探索肿瘤与炎症对巨噬细胞TSPO 靶向PET 示踪剂18F-DPA-714 摄取的差异，研究18F-DPA-714作为潜在的鉴别肿瘤与炎症PET 显像剂的价值。
方法：HT29, A549, U87MG, INS-1, 4T1肿瘤模型(n=4-6) 通过对裸鼠皮下接种5×106相应肿瘤细胞建立。FVB 小鼠通过肌注20 μl松节油建立后肢肌肉炎症模型。当肿瘤生长达到长到100-300 mm3(接种后3-5周)后，对肿瘤小鼠行18F-DPA-714 microPET 10分钟静态显像。在炎症建模后的第1,3,6,10,14,19及26天进行18F-DPA-714 microPET 显像。在肿瘤及炎症处通过ROI法分析肿瘤及炎症对示踪剂的摄取，并对比各种肿瘤示踪剂摄取与炎症摄取的差异。同时，对肿瘤及炎症组织行TSPO 免疫荧光染色，并分析其与microPET 显像的相关性。
结果：肿瘤对18F-DPA-714 的摄取相对较低。HT29，A549,U87MG,INS-1,4T1肿瘤对18F-DPA-714 的摄取分别为0.91±0.08%ID/g，0.46±0.28 %ID/g, 1.69±0.67%ID/g，1.13±0.33%ID/g, 1.22±0.55%ID/g。炎症肌肉在建模后对18F-DPA-714 的摄取除建模后第1天(1.71±0.18%ID/g) 外，其余时间点炎症摄取(3.20±0.27%ID/g，4.02±0.64%ID/g, 3.70±0.43%ID/g, 3.50±0.43%ID/g,3.09±0.48%ID/g，3.77±0.64%ID/g)均高于5 种肿瘤对18F-DPA-714 的摄取平均值(1.08±0.56%ID/g)。TSPO 免疫荧光染色可见炎症组织TSPO 表达明显高于5 种肿瘤组织内TSPO 的表达，与PET 显像结果相一致。
结论：除了急性炎症第一天，18F-DPA-714 在炎症中的摄取要明显高于肿瘤摄取。18F-DPA-714 具有潜在的鉴别炎症与肿瘤的临床转化价值。
目的：通过建立小鼠外周性肌肉炎症模型，本部分内容主要研究18p-DPA-714，一种新型巨噬细胞转动蛋白(translocator protein,TSPO) 靶向示踪剂，在体外及体内对巨噬细胞的示踪能力，及其对外周性肌肉炎症PET 显像的价值及摄取规律，从而为炎症特异性PET 显像提供一种新方法。
方法：体外细胞实验包括利用小鼠巨噬细胞系RAW 264.7，分析其对18p-DPA-714 的细胞摄取(cell uptake) 与细胞释放(cell efflux) 特点，其中部分细胞同时使用TSPO 阻断剂PK11195 ，来验证细胞摄取的特异性。体内显像实验使用PVB 小鼠，通过肌肉注射20μl松节油的方法建立小鼠下肢肌肉炎症模型，并在炎症建模后的不同时间点(1，3，6，10,14,19 及26 天)行小鼠18p-DPA-714microPET 显像，用感兴趣区(ROI)法勾画并测定不同时间点小鼠炎症肌肉对18p-DPA-714 的摄取值，绘制时间-摄取曲线，纵向研究炎症对示踪剂摄取的规律。同时，在炎症建模后的第3天，选取若干模型小鼠行TSPO 阻断剂PK11195 取代(displacement) 实验，并通过1 小时动态PET 显像绘制炎症肌肉处对示踪剂摄取的动态曲线(dynamic curve) ，来验证其对18p-DPA-714 摄取的阻断效果。取建模后第1 天及第6 天的小鼠炎症肌肉组织做冰冻切片，对其行CD 68 巨噬细胞免疫荧光染色，研究其与PET 显像的相关性。取建模后第1、6、22 天的小鼠炎症肌肉做冰冻切片，行18p-DPA-714 放射性自显影分析，研究其与PET 显像的相关性。
结果：巨噬细胞对18p-DPA-714 的摄取在共孵育开始到1小时内呈逐渐升高趋势，1 小时巨噬细胞对示踪剂的摄取可达45.55±1.73%AD。该摄取可被阻断剂PK11195 选择性地阻断。细胞释放实验，在更换培养基1 小时后仍有21.55±2.05%AD 的放射性保留在巨噬细胞内，2 小时后该值为9.04±1.12%AD。小鼠microPET 显像实验中，炎症处肌肉在建模后第6天摄取达到最高峰(4.02±0.64 %ID/g），之后开始缓慢摄取下降，建模后第26天炎症处摄取为2.77±0.64 %ID/g。建模后3天的1小时动态阻断剂取代显像中，炎症处18F-DPA-714摄取可被PK11195特异性地取代。放射自显影结果显示炎症建模后第6天切片对18F-DPA-714的结合明显高于第1天及第22天。CD 68巨噬免疫荧光染色发现，炎症建模后第6天炎症肌肉切片较炎症后第1天肌肉切片有更多的荧光信号。
结论：18F-DPA-714是一种巨噬细胞TSPO特异性PET示踪剂，可以用来动态监测炎症部位巨噬细胞的浸润。慢性炎症对18F-DPA-714的摄取要高于急慢性期炎症，表明慢性炎症阶段有更多的巨噬细胞浸润。
研究内容二 小鼠外周炎症模型炎性新生血管18F-AlfatideⅡ显像
目的：18F-Alfatide Ⅱ(18F-AF-NOTA-E[PEG4-C(RGDfk)]2）为新生血管靶向性示踪剂。本研究旨在探索18F-AlfatideⅡmicroPET显像在炎症性新生血管成像中的价值及可行性，并分析急性与慢性炎症对18F-AlfatideⅡ摄取的变化规律。
方法：细胞实验使用小鼠来源巨噬细胞系RAW246.7，研究其在正常件下对18F-AlfatideⅡ的细胞摄取水平（cell uptake）。动物实验使用FVB小鼠，通过肌注20μl松节油建立后肢肌肉炎症模型。并在炎症建模后的不同时间点（第1，2，4，8，12，16及26天）行小鼠18F-AlfatideⅡmicroPET显像，用感兴趣区(ROI)法勾画并测定不同时间点小鼠炎症肌肉对18F-Alfatide Ⅱ的摄取值，绘制时间-摄取曲线，纵向研究炎症对示踪剂摄取的规律。同时，在炎症建模后的第9天，选取若干模型小鼠，在PET显像前注射没有放射性标记的RGD多肽(10 mg/kg)，再行18F-AlfatideⅡPET显像，来验证炎症肌肉处对18F-Alfatide Ⅱ摄取的特异性。取建模后第1天及第12天的小鼠炎症肌肉组织做冰冻切片，对其行CD 31血管内皮细胞免疫荧光染色，研究其与PET显像的相关性。
结果：巨噬细胞对18F-AlfatideⅡ的摄取呈现明显的低水平，在摄取实验2小时点，巨噬细胞对示踪剂的摄取仅有0.18±0.03%AD。MicroPET显像中，炎症肌肉处的18F-Alfatide Ⅱ在第2～12天内的摄取逐渐升高趋势，在炎症慢性期（建模后第12天）18F-Alfatide Ⅱ摄取出现最大值(1.87±0.35 %ID/g)。注射了未标记的RGD阻断剂的模型小鼠的炎症处18F-AlfatideⅡ摄取明显低于未注射该阻断剂组（1.66±0.04 vs. 0.77±0.16 %ID/g,P=7.33×10-4）。CD 31荧光染色可见小鼠炎症建模后第12天炎症肌肉切片CD 31荧光强度信号明显高于第1天，与PET显像结果相一致。
结论：巨噬细胞表面较少表达整合素αvβ3，炎症处对18F-AlfatideⅡ的摄取来自炎性新生血管。18F-AlfatideⅡPET显像能动态而准确地监测炎性新生血管在炎症进展中的动态变化情况。慢性炎症阶段18F-AlfatideⅡ摄取显著高于急性期炎症摄取，表明慢性期新生血管程度要明显高于急性炎症期。
研究内容三 巨噬细胞清除后炎症模型18F-DPA-714及18F-Alfatide ⅡPET显像及清除巨噬细胞对炎性新生血管的影响
目的：本研究旨在利用18F-Alfatide Ⅱ(18F-AIF-NOTA-E[PEG4-C(RGDfk)]2）microPET新生血管显像及18F-DPA-714巨噬细胞TSPO显像，探索巨噬细胞清除后小鼠肌肉炎症模型的炎症部位对两种示踪剂摄取的变化，并分析两者的联系，研究巨噬细胞清除对炎性新生血管的作用。
方法：动物实验使用FVB小鼠，通过肌注20μl松节油建立后肢肌肉炎症模型。将炎症模型小鼠随机分成3组，每组4只，其中组1及组2小鼠在第3天接受尾静脉注射1.4 mg (200 μl)氯膦酸二钠脂质体(Clodronate Liposomes，Clophosome)，之后每2-3天接受尾静脉注射0.7 mg(100μl)氯膦酸二钠脂质体（方案1）。组3小鼠在炎症模型建模开始前2天接受尾静脉注射1.4 mg(200 μl)氯膦酸二钠脂质，之后每2-3天接受尾静脉注射0.7 mg(100μ)氯膦酸二钠脂质体（方案2）。组1的小鼠在炎症建模后的第6，10及14天行18F-DPA-714 PET显像，观察巨噬细胞清除过程中炎症部位对示踪剂摄取的动态变化情况。组2及组3的小鼠在炎症建模后的第12天进行了18F-AlfatideⅡPET显像，比较不同巨噬细胞清除方案下对炎性新生血管程度的影响。取炎症建模后第6天及第12天接受了巨噬细胞清除剂干预的小鼠炎症肌肉行冰冻切片，并对其进行CD 68巨噬细胞免疫荧光染色及CD 31血管内皮细胞染色。染色结果与PET显像进行比较。
结果：相对于同时期未接受巨噬细胞清除小鼠，接受了巨噬细胞清除(方案1)的小鼠炎症对18F-DPA-714摄取在建模后第6天及第10天明显降低（第6天：3.30±0.18 v.s. 4.02±0.64 %ID/g，P=0.02; 第10天：3.16±0.32 v.s. 3.70±0.43 %ID/g,P=0.03）。炎症后第14天，除去巨噬细胞组与未除去巨噬细胞组的18F-DPA-714摄取未显现出明显的差异(3.03±0.69 vs. 3.50±0.43 %ID/g，P=0.19)。接受除巨噬细胞方案2的小鼠，其建模后第12天的炎症处18F-AlfatideⅡ摄取较接受除巨噬细胞方案1组小鼠炎症对示踪剂摄取减低（0.98±0.19 v.s. 1.49±0.13 %ID/g，P=2.97×10-4）。接受了巨噬细胞清除的炎症肌肉CD 68、CD 31荧光信号明显小于同期未接受巨噬细胞清除的炎症肌肉，与PET显像结果相一致。
结论：巨噬细胞清除后，炎症部位18F-DPA-714摄取降低，表明18F-DPA-714PET显像可以观察到巨噬细胞的数目变化情况。巨噬细胞清除后炎症处18F-AlfatideⅡ摄取下降，表明巨噬细胞清除可减少炎症部位炎性新生血管的生成，并可通过18F-AlfatideⅡPET显像进行监测。
研究内容四 18F-DPA-714 PET 显像在鉴别肿瘤与炎症中的价值
目的：通过建立肿瘤小鼠模型与炎症小鼠模型，本研究旨在探索肿瘤与炎症对巨噬细胞TSPO 靶向PET 示踪剂18F-DPA-714 摄取的差异，研究18F-DPA-714作为潜在的鉴别肿瘤与炎症PET 显像剂的价值。
方法：HT29, A549, U87MG, INS-1, 4T1肿瘤模型(n=4-6) 通过对裸鼠皮下接种5×106相应肿瘤细胞建立。FVB 小鼠通过肌注20 μl松节油建立后肢肌肉炎症模型。当肿瘤生长达到长到100-300 mm3(接种后3-5周)后，对肿瘤小鼠行18F-DPA-714 microPET 10分钟静态显像。在炎症建模后的第1,3,6,10,14,19及26天进行18F-DPA-714 microPET 显像。在肿瘤及炎症处通过ROI法分析肿瘤及炎症对示踪剂的摄取，并对比各种肿瘤示踪剂摄取与炎症摄取的差异。同时，对肿瘤及炎症组织行TSPO 免疫荧光染色，并分析其与microPET 显像的相关性。
结果：肿瘤对18F-DPA-714 的摄取相对较低。HT29，A549,U87MG,INS-1,4T1肿瘤对18F-DPA-714 的摄取分别为0.91±0.08%ID/g，0.46±0.28 %ID/g, 1.69±0.67%ID/g，1.13±0.33%ID/g, 1.22±0.55%ID/g。炎症肌肉在建模后对18F-DPA-714 的摄取除建模后第1天(1.71±0.18%ID/g) 外，其余时间点炎症摄取(3.20±0.27%ID/g，4.02±0.64%ID/g, 3.70±0.43%ID/g, 3.50±0.43%ID/g,3.09±0.48%ID/g，3.77±0.64%ID/g)均高于5 种肿瘤对18F-DPA-714 的摄取平均值(1.08±0.56%ID/g)。TSPO 免疫荧光染色可见炎症组织TSPO 表达明显高于5 种肿瘤组织内TSPO 的表达，与PET 显像结果相一致。
结论：除了急性炎症第一天，18F-DPA-714 在炎症中的摄取要明显高于肿瘤摄取。18F-DPA-714 具有潜在的鉴别炎症与肿瘤的临床转化价值。